【摘要】：背景與目的：腦卒中因發(fā)病率高，致殘率高和死亡率高儼然已成為人類健康的重要殺手。隨著中國社會老齡化，中國的腦卒中患者逐年增多，這嚴重影響了老年人的生活健康和生活質(zhì)量。動物研究證實腦卒中后血腦屏障（Blood brain barrier, BBB）的開放是導致腦水腫、增加腦出血轉(zhuǎn)換風險和加重腦實質(zhì)損害的重要原因，因此調(diào)控卒中后血腦屏障的損害對于減輕疾病損害，延緩疾病進程，改善預后有重要的作用。以往對BBB的研究大都集中在血管內(nèi)皮細胞，而忽略了周圍其他支持性細胞的作用，實際上內(nèi)皮細胞與其周圍的細胞外基質(zhì)、外周細胞、神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞共同組成神經(jīng)血管單元（Neurovascullarunite，NVU）, NVU對局部血管及神經(jīng)功能的調(diào)控越來越得到神經(jīng)病學領(lǐng)域研究者的共識。細胞外基質(zhì)（Extra cell matrix）作為NVU中連接各個細胞的“紐帶”不僅在結(jié)構(gòu)上對內(nèi)皮細胞，外周細胞及膠質(zhì)細胞起支撐的作用，在功能上還能參與相關(guān)信號通路（如：整合素信號通路）的起始和傳導，因此ECM在NVU中調(diào)控中具有重要作用。Fibulin-5是ECM家族Fibulin中的新成員，F(xiàn)ibulin-5能通過整合素及其受體增強內(nèi)皮細胞與細胞外基質(zhì)的粘附，這有利于維持BBB結(jié)構(gòu)的完整，另外內(nèi)皮細胞與細胞外基質(zhì)的粘附能促進緊密連接蛋白（Tight junction，TJ，如：occludin）的表達，從而縮小內(nèi)皮細胞間縫隙，減少BBB損害。在信號傳導方面，F(xiàn)ibulin-5拮抗纖維連接蛋白與內(nèi)皮細胞表面的整合素受體結(jié)合抑制整合素信號通路傳導，減少活性氧（Reactiveoxygen species, ROS）的產(chǎn)生，同時Fibulin-5還能與超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）結(jié)合介導細胞外ROS的降解， ROS能直接影響內(nèi)皮細胞功能，使內(nèi)皮細胞異常收縮，加重局部腦組織缺血，同時ROS還能通過NF-κB通路激活酪氨酸激酶和基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinase, MMPs），降解ECM及緊密連接蛋白，增加BBB破壞。此外Fibulin-5還是一個血管生長抑制因子，能減少血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor, VEGF）的表達，VEGF作為血管內(nèi)皮生長因子會增加BBB漏出。鑒于本課題組之前的研究發(fā)現(xiàn)大鼠大腦中動脈阻塞（Midlle cerebral artery occlusion）后缺血側(cè)腦組織中Fibulin-5表達升高，結(jié)合上面提到的Fibulin-5對BBB的保護作用，我們推測Fibulin-5是腦缺血再灌注損傷后組織產(chǎn)生的具有自我修復功能的ECM蛋白，若我們將這種自我修復能力增強，也許能減輕腦缺血再灌注后的BBB的損害，為腦卒中找到新的治療靶點。腺病毒顱內(nèi)立體定位注射技術(shù)常用于抑制或過表達某種基因，從而觀察該基因?qū)χ袠猩窠?jīng)系統(tǒng)疾病的影響，該方法成功率高，操作簡單，但是高滴度的腺病毒會引起局部炎癥反應(yīng)，因此本實驗擬首先甄選出最佳Fibulin-5腺病毒滴度，使腺病毒達到最佳轉(zhuǎn)染效率的同時毒副作用最小。再用最佳滴度的Fibulin-5腺病毒轉(zhuǎn)染實驗大鼠使大鼠局部腦組織過表達Fibulin-5，觀察過表達Fibulin-5對大鼠腦缺血再灌注損傷后BBB通透性、緊密連接蛋白occludin、ROS、VEGF及MMPs表達的影響，從而探索其影響腦缺血再灌注損傷后血腦屏障功能的可能機制。 方法： 1.32只成年雄性SD大鼠（200-250g）隨機分成4組，即正常組，低滴度腺病毒組，中滴度腺病毒組，高滴度腺病毒組，分別予以等體積的生理鹽水和梯度腺病毒滴度的皮質(zhì)及海馬多點注射。病毒注射后7天，冰凍切片免疫熒光檢測各組綠色熒光蛋白(Green fluorescentprotein,GFP)的熒光分布及強度（每組4只大鼠），ELISA檢測各組大鼠腦組織IL-1β的含量（每組4只大鼠）。 2.112只成年雄性SD大鼠（200-250g）隨機分成4組，即假手術(shù)組（S）、腦缺血組(I/R)、腦缺血加過表達Fibulin-5腺病毒載體干預組（I/R+Ad-FBLN5）以及腦缺血加空腺病毒載體干預組（I/R+Ad-HK），其中I/R+Ad-FBLN5組及I/R+Ad-HK組的大鼠在腦缺血前7d接受腺病毒或空腺病毒注射。各組大鼠在腦缺血再灌注后24h，用免疫蛋白印跡（western-blot，WB）及實時熒光定量PCR（rt-PCR）檢測Fibulin-5、occludin、VEGF及MMP-9的蛋白及mRNA表達，伊文思藍(Evan Blue)漏出和腦組織水含量檢測血腦屏障的通透性，免疫熒光雙標記內(nèi)皮細胞(RECA1)與occludin，觀察緊密連接蛋白在內(nèi)皮細胞周圍的排列情況，TTC測定腦梗死體積，所有大鼠在處死前進行神經(jīng)功能評分，評估神經(jīng)功能。每組28只大鼠中Western blot8只（4只用于提取大鼠腦組織膜蛋白，4只用于提取大鼠腦組織總蛋白），免疫熒光、TTC、伊文思藍、RT-PCR、腦組織水含量檢測各4只大鼠。 結(jié)果： 1：激光共聚焦結(jié)果顯示：正常組大鼠注射點周圍皮質(zhì)及海馬未見明顯綠色熒光，低滴度組大鼠皮質(zhì)及海馬注射點周圍分別可見少量熒光分布，中滴度組大鼠和高滴度組大鼠注射點周圍綠色熒光密集分布，中滴度組合高滴度組腺病毒的轉(zhuǎn)染效率幾乎相同（P0.05）都比低滴度組轉(zhuǎn)染效率高（P0.05）。ELISA結(jié)果顯示：腺病毒顱內(nèi)注射后引起腦組織炎癥反應(yīng)，高滴度組較生理鹽水組IL-1β升高最明顯（P0.05）,中滴度組和低滴度組IL-1β升高差別不明顯（P0.05）。 2：Western-blot及rt-PCR結(jié)果顯示I/R+Ad-FBLN5組大鼠缺血側(cè)腦組織Fibulin-5的蛋白及mRNA水平均明顯高于其他實驗組（P0.01），說明腺病毒轉(zhuǎn)染成功使大鼠局部腦組織Fibulin-5高表達。再灌注后24h，I/R組大鼠缺血側(cè)腦組織可見明顯的伊文思藍漏出（P0.01），腦組織水含量也顯著增加（P0.01），說明BBB破壞，漏出增加。I/R+Ad-HK組大鼠與I/R組大鼠之間的EB漏出及腦組織水含量無明顯差異（P0.05）。而用過表達Fibulin-5的腺病毒干預后，大鼠腦組織伊文思藍漏出及腦組織水含量明顯減少（P0.01），說明Fibulin-5減輕了BBB的破壞。TTC結(jié)果顯示，I/R+Ad-FBLN5組大鼠的腦梗死灶較I/R組及I/R+Ad-HK組明顯縮小(P0.01)，神經(jīng)功能評分也明顯優(yōu)于后兩者（P0.01），說明Fibulin-5通過減輕BBB破壞起到了腦保護作用。 3. Western-blot及rt-PCR結(jié)果顯示，與I/R組相比I/R+Ad-FBLN5組大鼠缺血側(cè)腦組織緊密連接蛋白occludin的蛋白及mRNA表達水平較明顯升高（P0.01），同時MMP-9和VEGF的蛋白表達水平明顯降低（P0.01）。激光共聚焦顯示，在正常情況下緊密連接蛋白occludin緊密排列在內(nèi)皮細胞（RECA1）周圍，缺血后24h，緊密連接蛋白開始降解和異位，F(xiàn)ibulin-5腺病毒干預后緊密連接蛋白的降解和異位減少。 結(jié)論： 1.隨著腺病毒滴度的增加，腺病毒的轉(zhuǎn)染效率升高，但是其炎癥反應(yīng)的副作用也相應(yīng)地增加，中滴度腺病毒既達到了有效的轉(zhuǎn)染效率同時又不會引起強烈的炎癥反應(yīng)，因此我們選取中滴度腺病毒作為我們實驗所用滴度。 2.腺病毒立體定位注射成功使干預組大鼠腦組織Fibulin-5表達升高，同時高表達的Fibulin-5減輕了腦缺血后BBB的破壞，縮小了腦梗死體積，改善了神經(jīng)功能缺損情況。 3.Fibulin-5對腦缺血后BBB的保護作用可能與其促進緊密連接蛋白occludin的表達以及降低MMP-9和VEGF的表達有關(guān)，F(xiàn)ibulin-5對BBB的保護作用為治療缺血性腦卒中，減輕BBB損害，，改善疾病預后提供了新的作用靶點。
文內(nèi)圖片：
圖片說明： A~D:皮質(zhì)生理鹽水、皮質(zhì)低滴度腺病毒、皮質(zhì)中滴度腺病毒、皮質(zhì)高滴度腺病毒E~H:海馬生理鹽水、海馬低滴度腺病毒、海馬中低度腺病毒、海馬高滴度腺病毒圖 1.1 不同滴度 Fibulin-5 腺病毒在大鼠皮質(zhì)及海馬中的擴散情況(×100,scalebar:100μm)Figure1.1 Fibulin-5 adenoviral gene delivery in cortex and hippocampus of rats(×100,scale bar=100μm)1:S 組; 2：I/R 組; 3:I/R+Ad-FBLN5 組; 4:I/R+Ad-HK 組
文內(nèi)圖片：
圖片說明： 1:S 組; 2：I/R 組; 3:I/R+Ad-FBLN5 組; 4:I/R+Ad-HK 組鼠腦缺血再灌注后 24h 各組大鼠腦組織 MMP-9 及 VEGF 蛋 The expression of MMP-9 and VEGF of brain tissue in rats ischemia/reperfusion1:S 組; 2：I/R 組; 3:I/R+Ad-FBLN5 組; 4:I/R+Ad-HK 組2.3 大鼠腦缺血再灌注后 24h 各組大鼠腦組織伊文思藍漏出re 2.3 Evan blue leakage of brain at 24h after ischemia/reper
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R743

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本文編號：2515254