本文關鍵詞： 神經(jīng)組織定向干細胞 感覺神經(jīng)元 背根神經(jīng)節(jié) 移植 神經(jīng)再生　出處：《第二軍醫(yī)大學》2014年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：臨床患者常見的腰部及下肢放射性痛多由腰椎間盤突出癥、腰椎管狹窄、腰骶椎不穩(wěn)定等原因造成的脊神經(jīng)根受壓所致，嚴重者可以造成患肢的運動功能喪失。椎板開窗、髓核摘除、神經(jīng)根減壓等手術治療，雖然可以使患者的運動功能及疼痛癥狀得到緩解，但患肢的麻木等感覺功能障礙卻難以恢復，這成為長期困擾臨床醫(yī)生的棘手問題。 神經(jīng)損傷后感覺功能受損的主要表現(xiàn)是患者的痛覺、溫度覺障礙以及繼發(fā)性的感覺性共濟運動失調(diào)。此外，感覺神經(jīng)元構(gòu)成神經(jīng)系統(tǒng)反射弧的傳入路徑，因此還可能造成各種生理性的反射功能喪失等嚴重后果。如陰部神經(jīng)的感覺功能缺損，可造成肛門反射異常而引起大便失禁；盆內(nèi)臟神經(jīng)的感覺功能缺損，可造成病人膀胱反射消失而引起尿潴留等一系列臨床癥狀�？梢�，神經(jīng)損傷后，修復患者的感覺功能，是提高神經(jīng)修復效果、改善患者生活質(zhì)量，必須重視的問題。 通過再生醫(yī)學移植神經(jīng)干細胞修復神經(jīng)損傷是公認的有效方法和手段，但目前注意點主要集中在損傷神經(jīng)的運動功能恢復方面，對感覺功能的恢復缺乏重視。本課題擬通過成體干細胞源性感覺神經(jīng)元移植，探討修復感覺缺損的可能性及機制。 通過再生醫(yī)學移植神經(jīng)干細胞的方法修復周圍感覺神經(jīng)缺損，首先必須解決移植細胞的種類、來源，和誘導分化為感覺神經(jīng)元細胞的問題。 骨髓神經(jīng)組織定向干細胞（neural tissue committed stem cells，NTCSCs），是骨髓間充質(zhì)干細胞的一種亞型，或組分，可以自然分化為神經(jīng)元細胞。NTCSCs可來源于自體、無倫理學爭議、避免了免疫排斥反應，并且取材容易，活性好，易于誘導分化，應是較為理想的移植用種子細胞來源。我們實驗室前期成功分離、培養(yǎng)了NTCSCs，并誘導分化為神經(jīng)元樣細胞，，用于修復周圍神經(jīng)缺損，取得了初步研究成果，但，由于該干細胞存在一定爭議，應用研究較少涉及。 Kondo T等通過Forskolin（腺苷酸環(huán)化酶激活劑）和成纖維細胞生長因子-2（fibroblast growth factor-2，F(xiàn)GF2）預誘導，再經(jīng)音猥因子(sonic hedgehog，SHH)和維甲酸（retinoic acid，RA）的聯(lián)合誘導，可以將C57小鼠的骨髓間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）誘導分化為特異性表達VGluT1（Ⅰ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運體）、calretinin（鈣結(jié)合蛋白）、P2X3（ATP調(diào)控的一種離子通道受體）等谷氨酸能感覺神經(jīng)元特異性標志蛋白的細胞，且可以在腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（Brain-derived neurotrophic factor，BDNF）存在的微環(huán)境中長期存活。這為我們通過骨髓NTCSCs獲得大量穩(wěn)定的可移植用的感覺神經(jīng)元提供了借鑒依據(jù)。 通過移植感覺神經(jīng)元的方法修復周圍神經(jīng)感覺缺損，還需要找到適宜的周圍神經(jīng)感覺缺損的動物模型。脊神經(jīng)節(jié)內(nèi)聚集著假單極感覺性神經(jīng)元，這種感覺神經(jīng)元負責接收來自軀體和四肢的感覺信息，并進一步傳遞至中樞神經(jīng)。背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元是一種終末分化神經(jīng)細胞，一旦死亡，不能再生，從而造成肢體的感覺功能出現(xiàn)異常。Helgren等采用腹腔注射過量吡哆醇的方法導致神經(jīng)纖維軸索變性及背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的壞死。后續(xù)研究證明，通過注射過量吡哆醇制作感覺神經(jīng)病動物模型的方法簡單、操作性強、重復性好，是目前神經(jīng)科學領域研究感覺神經(jīng)病的常用模型。 綜上所述，本課題擬在成功制備背根神經(jīng)節(jié)病變大鼠動物模型基礎上，研究同種異體骨髓NTCSCs源性感覺神經(jīng)元樣細胞移植，修復感覺神經(jīng)缺損的效果與機制，探討成體干細胞源性感覺神經(jīng)元移植，修復感覺神經(jīng)缺損的可行性，為臨床治療周圍神經(jīng)感覺缺損提供理論和實驗依據(jù)。 第一部分骨髓NTCSCs源性感覺神經(jīng)元的分離、培養(yǎng)、誘導分化及鑒定 研究目的：獲取移植應用所需的骨髓NTCSCs源性感覺神經(jīng)元細胞。 材料和方法：從成年SD大鼠骨髓組織中分離獲得單個核細胞，采用先貼壁培養(yǎng)篩選、后無血清神經(jīng)干細胞培養(yǎng)液懸浮培養(yǎng)的方式，分離、擴增出單克隆生長的NTCSCs；對得到的NTCSCs進行鑒定；擴增得到的NTCSCs采用SHH和RA等聯(lián)合誘導的方法使其向感覺神經(jīng)元方向分化；對得到的骨髓NTCSCs源性感覺神經(jīng)元進行鑒定。 結(jié)果：SD大鼠骨髓組織中的單個核細胞采用單細胞克隆、無血清懸浮培養(yǎng)得到大量的神經(jīng)球；神經(jīng)球細胞表達神經(jīng)干細胞特異蛋白Nestin和組織定向干細胞特異蛋白CXCR4，同時具有MSCs表型特征：CD29（97.81%）、CD44（91.31%）、CD90（93.85%）、CD105（95.08%）、CD34（3.78%）、CD45（1.59%）；超微結(jié)構(gòu)顯示多個核仁、豐富的線粒體、常染色質(zhì)較多等干細胞特征。神經(jīng)球細胞經(jīng)SHH和RA聯(lián)合誘導后表現(xiàn)神經(jīng)元樣細胞外形特征，并且表達NeuN、MAP-2、β-tublinⅢ、GluR-4等蛋白；Gria4、Gria3、Calb2、Pou4f1、Tau、NeuN、MAP-2、Tubulin Ⅲ、NF、GFAP、Neurogenin2等基因表達上調(diào)，Nestin、Ret、GATA3等基因表達下調(diào)；Tau、MAP-2、NF、NSE、NeuN、Gria4等蛋白表達量增加，Nestin蛋白表達降低。 結(jié)論：骨髓組織中存在NTCSCs，可以分離，并能通過細胞球懸浮培養(yǎng)的方法得到大量擴增；NTCSCs在SHH和RA的聯(lián)合誘導作用下可以分化為具有谷氨酸能特征的感覺神經(jīng)元樣細胞。 第二部分周圍神經(jīng)感覺缺損動物模型的建立 研究目的：建立周圍神經(jīng)感覺缺損動物模型。 材料和方法：成年雌性SD大鼠，體重180-220g，采用早晚兩次，連續(xù)8天，腹腔注射800mg/kg/d吡哆醇鹽酸鹽，進行周圍神經(jīng)感覺缺損動物模型的制作。通過動物功能行為學、神經(jīng)電生理學、受損背根神經(jīng)節(jié)及坐骨神經(jīng)的組織形態(tài)學觀察與計量等實驗方法，對得到的動物模型進行綜合性評價。 結(jié)果：造模后動物步態(tài)蹣跚、平衡及穩(wěn)定性較差；足底溫度覺和痛覺敏感度降低；坐骨神經(jīng)感覺潛伏期延長，傳導速度降低；背根神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元萎縮、變性、壞死，神經(jīng)纖維軸索變性，排列疏松紊亂，伴有髓鞘塌陷、扭曲等。 結(jié)論：通過腹腔注射過量吡哆醇的方法可以制作周圍神經(jīng)感覺缺損動物模型。 第三部分骨髓NTCSCs源性感覺神經(jīng)元移植修復大鼠周圍神經(jīng)感覺缺損的作用與機制 研究目的：探討骨髓NTCSCs源性感覺神經(jīng)元樣細胞移植修復SD大鼠周圍神經(jīng)感覺缺損的作用與機制。 材料和方法：采用顯微注射的方法，將CM-Dil標記的骨髓NTCSCs源性感覺神經(jīng)元細胞，移植進入吡哆醇誘導的感覺缺損模型動物的L4、L5背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)。分別于移植術后第2周、4周、8周、12周對模型動物進行行為學觀察；感覺功能評測；坐骨神經(jīng)電生理學檢測；坐骨神經(jīng)及背根神經(jīng)節(jié)形態(tài)學觀察及計量學分析；熒光金（FG）逆行示蹤等實驗方法與手段，觀測移植的感覺神經(jīng)元對模型動物感覺功能的修復情況。 結(jié)果：移植骨髓NTCSCs源性感覺神經(jīng)元后，模型動物的一般姿勢、動作步態(tài)隨時間的延長出現(xiàn)明顯好轉(zhuǎn)的跡象；足底溫度覺和痛覺敏感度逐漸恢復；坐骨神經(jīng)有髓神經(jīng)纖維計數(shù)明顯增加，感覺潛伏期縮短、感覺神經(jīng)傳導速度增加，且與時間線性相關；免疫熒光染色CM-Dil標記的骨髓NTCSCs源性感覺神經(jīng)元在DRG內(nèi)遷移、定植，并表達NeuN和GluR-4蛋白；DRG內(nèi)檢測到FG標記的神經(jīng)元細胞數(shù)量顯著增多。 結(jié)論：移植骨髓NTCSCs源性感覺神經(jīng)元可以有效修復周圍神經(jīng)感覺缺損。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R745

【參考文獻】

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本文編號：1476812