本文關鍵詞：MLIF在腦缺血中的神經保護作用及其機制研究

  更多相關文章： 氧糖剝奪 神經保護 單核細胞遷移抑制因子(MLIF) 真核細胞翻譯延長因子(eEF1A2) 凋亡

【摘要】：研究目的:腦卒中,主要由缺血性腦卒中和出血性腦卒中組成,其中87%的腦卒中患者為缺血性腦卒中。腦卒中一直以其高致殘率和高死亡率嚴重威脅著世界人民的健康。大量研究表明腦卒中發(fā)病機制錯綜復雜,涉及炎癥、凋亡、細胞毒性、氧化應激等多種環(huán)節(jié),其中腦缺血引起的炎癥反應和神經細胞的凋亡和壞死是引起腦卒中患者腦細胞死亡,進而導致腦組織病變的重要機制。因此,尋找具有抗炎和抗神經細胞凋亡的防治藥物具有深遠的科學價值和重要的社會意義。單核細胞遷移抑制因子(monocyte locomotion inhibitory factor;MLIF),是一種具有熱穩(wěn)定性的五肽。本課題組在前期的研究中發(fā)現MLIF可以顯著降低大鼠、小鼠腦缺血模型的腦梗死面積,并發(fā)現MLIF可以與腦微血管內皮細胞(b End3細胞)中真核翻譯延長因子1A1(eukaryotic translation elongation factor 1 A1,e EF1A1)結合,作用于e NOS的3’-UTR來上調e NOS蛋白的表達,進而降低粘附分子ICAM-1和VCAM-1的表達水平,發(fā)揮對腦缺血的保護作用。為進一步探討MLIF的腦缺血保護作用機制,本課題擬進一步在神經細胞和整體動物水平研究MLIF的神經保護作用及其機制,為腦卒中的預防和治療提供新的研究思路。研究方法與結果:1.我們分別運用氧糖剝奪(oxygen and glucose deprivation,OGD)和缺氧缺糖復氧(OGD/R)的方法建立人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y體外缺氧/復氧模型,分別采用MTT實驗,LDH實驗,流式細胞術和Hoechst 33258染色方法檢測MLIF對氧糖剝奪后SH-SY5Y細胞的生存率和凋亡率的影響。結果顯示我們建立的OGD模型成功誘導了細胞的損傷,并確定缺氧6h為較佳缺氧時間;MTT實驗結果顯示MLIF可以顯著升高OGD以及OGD/R后細胞的生存率(P0.01);LDH實驗結果顯示,MLIF可以顯著改善OGD誘導的神經損傷(P0.01);流式細胞術和Hoechst33258染色實驗結果顯示,MLIF可以顯著改善由于OGD以及OGD/R引起的細胞的凋亡和壞死(P0.01)。2.我們運用western blot實驗檢測MLIF對OGD后SH-SY5Y細胞內凋亡相關蛋白表達的影響。我們發(fā)現在OGD后的SH-SY5Y細胞內,p-JNK、p-p38、p-ERK、p53、cleaved caspase3、cleaved caspase9凋亡相關蛋白的表達顯著升高(P0.01 or P0.05),給予MLIF處理后,相比于模型組,p-JNK、p53、cleaved caspase3和cleaved caspase9蛋白的表達顯著降低(P0.01 or P0.05),p-p38和p-ERK的表達未發(fā)生顯著變化。以上結果表明,MLIF可以通過抑制p-JNK/p53凋亡通路來抑制OGD誘導的神經細胞凋亡。3.利用pull-down實驗尋找MLIF在大鼠原代神經元細胞和SH-SY5Y細胞內的結合蛋白。通過蛋白之間的pull-down實驗,及SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色,發(fā)現MLIF的結合蛋白分子量約為50KDa,取特異性蛋白條帶進行酶解結合質譜鑒定找出MLIF在細胞中的特異性結合蛋白,比對數據庫中肽段匹配數并對比分子量,確定50KDa的蛋白e EF1A2(eukaryotic translation elongation factor 1A2)為MLIF在神經細胞內的結合蛋白。我們運用western blot的方法在原代神經元細胞和SH-SY5Y細胞上做了進一步驗證。為了進一步驗證MLIF與該靶點蛋白在神經細胞內的結合,我們運用免疫熒光技術采用激光共聚焦顯微鏡觀察,發(fā)現FITC-MLIF與e EF1A2在SH-SY5Y細胞的胞漿內存在共定位。以上結果表明MLIF在神經細胞中特異性結合的蛋白為e EF1A2。4.利用siRNA技術,在SH-SY5Y細胞中轉染e EF1A2 siRNA,檢測MLIF對OGD誘導細胞損傷的保護作用。MTT實驗結果顯示,相對于NC陰性對照組,e EF1A2基因干擾組細胞生存率顯著降低(P0.01);流式細胞術和Hoechst 33258染色檢測細胞的凋亡,結果顯示相比于NC陰性對照組細胞凋亡率,e EF1A2基因干擾組細胞凋亡率顯著升高,細胞核固縮嚴重,凋亡細胞數顯著增加(P0.01)。Western blot結果顯示,e EF1A2基因干擾后MLIF抑制凋亡蛋白p-JNK/p53的作用減弱(P0.05)。5.利用大腦中動脈阻斷(middle cerebral artery occlusion,MCAO)法制作大鼠腦缺血再灌注模型,研究MLIF對于腦缺血動物模型的神經保護作用及其機制。實驗分為假手術組、模型組和MLIF組,尼氏染色檢測手術后7天,14天和28天大腦皮層和海馬神經元細胞形態(tài),用相應的檢測試劑盒檢測手術后7周動物血清內氧化應激指標SOD和MDA以及炎癥因子IL-1β和TNF-α的變化,Morris水迷宮實驗檢測各組動物的空間學習記憶能力的變化;結果顯示,MLIF可以改善大鼠腦缺血后大腦皮層和海馬區(qū)神經元形態(tài),并提高動物的記憶能力,升高SOD的含量,降低MDA和炎癥因子IL-1β、TNF-α的含量。結論:1.MLIF可以顯著提高氧糖剝奪后SH-SY5Y細胞的生存率,抑制氧糖剝奪誘導的細胞凋亡和壞死。2.MLIF在SH-SY5Y細胞中與e EF1A2相結合,抑制p-JNK/p53信號轉導通路從而減少OGD誘導的細胞凋亡。3.MLIF可以通過減少大鼠缺血再灌注恢復期大腦皮層和海馬神經元損傷,并改善腦缺血再灌注導致的記憶損傷,升高SOD含量清除氧自由基,降低MDA含量抗脂質過氧化,降低炎癥因子IL-1β、TNF-α水平來發(fā)揮神經保護作用。
【關鍵詞】：氧糖剝奪 神經保護 單核細胞遷移抑制因子(MLIF) 真核細胞翻譯延長因子(eEF1A2) 凋亡
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R743
【目錄】：

• 摘要7-10
• Abstract10-13
• 縮略詞表13-15
• 前言15-18
• 第一部分 MLIF對神經細胞氧糖剝奪損傷的作用研究18-29
• 一、實驗材料與方法18-21
• （一）實驗材料18-19
• （二）實驗方法19-21
• 二、實驗結果21-27
• （一）MLIF提高OGD誘導的SH-SY5Y細胞的細胞生存率21-23
• （二）MLIF 降低 OGD 誘導 SH-SY5Y 細胞的細胞凋亡23-26
• （三）MLIF增加OGD/R誘導的SH-SY5Y細胞的細胞生存率并抑制細胞凋亡26-27
• 三、討論27-29
• 第二部分 MLIF的抗OGD誘導的神經細胞凋亡作用機制研究29-59
• 一、實驗材料和方法29-42
• （一）實驗材料29-32
• （二）實驗方法32-42
• 二、實驗結果42-54
• （一） MLIF對OGD誘導的SH-SY5Y細胞內caspase相關凋亡蛋白表達水平的影響42-43
• （二） MLIF對OGD誘導的SH-SY5Y細胞內p-JNK蛋白表達水平的影響43-44
• （三） MLIF對OGD誘導的SH-SY5Y細胞內p38和ERK蛋白表達水平的影響44-45
• （四）MLIF對OGD誘導的SH-SY5Y細胞內p53蛋白表達的影響45-46
• （五）神經細胞中MLIF特異性結合蛋白46-50
• （六）eEF1A2 RNA干擾對MLIF的神經保護作用的影響50-54
• 三、討論54-59
• 第三部分 MLIF對于大鼠腦缺血后的神經保護作用研究59-69
• 一、實驗材料與方法59-62
• （一）實驗材料59-60
• （二）實驗方法60-62
• 二、實驗結果62-67
• （一）MLIF對腦缺血后大鼠神經元的影響62-65
• （二）MLIF對腦缺血后大鼠記憶能力的影響65
• （三）MLIF對腦缺血后大鼠血清中SOD和MDA的影響65-66
• （四） MLIF對缺血后大鼠血清內炎癥因子IL-1β 和TNF-α 的影響66-67
• 三、討論67-69
• 結論69-70
• 參考文獻70-77
• 綜述 eEF1A2的非經典作用研究進展77-83
• 1. eEF1A2結構與經典作用77-78
• 2. eEF1A2與腫瘤78
• 3. eEF1A2與凋亡78-79
• 4. eEF1A2與神經系統79-80
• 5. 總結80
• 參考文獻80-83
• 在讀期間發(fā)表論文和科研工作情況說明83-84
• 致謝84-85

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1 盧玲;血小板源性生長因子神經保護作用的研究進展[J];國外醫(yī)學(生理、病理科學與臨床分冊);2003年05期

2 吳樂,陳文軍;雌激素的神經保護作用及其機理[J];神經解剖學雜志;2005年01期

3 馬鐵軍;高宗科;王毅;王東平;周其全;;新型彈性蛋白酶抑制劑——西維來司鈉的神經保護作用[J];國際神經病學神經外科學雜志;2011年04期

4 朱慧琛;何征宇;王祥瑞;;右美托咪定的神經保護作用及其臨床應用[J];上海醫(yī)學;2012年08期

5 張雅德;;雙重作用的藥物可提供良好的神經保護作用[J];國外醫(yī)學情報;2001年03期

6 歐冊華,張毅,李惠芳;鎂對兔全腦缺血神經保護作用及氨基酸在其中作用的實驗研究(摘要)[J];昆明醫(yī)學院學報;2003年03期

7 郭家彬;鐵璐;Diana N Krause;Sue P Duckles;李學軍;;雌激素神經保護作用機制:線粒體功能的調節(jié)[J];生理科學進展;2010年03期

8 王潔潔;徐家麗;;粒細胞集落刺激因子的神經保護作用機制[J];臨床兒科雜志;2011年04期

9 徐蓉;盧明;;銅及銅鋅超氧化物歧化酶對神經保護作用的研究進展[J];國際神經病學神經外科學雜志;2011年05期

10 徐濤,曲方;阿司匹林的神經保護作用[J];中國臨床神經科學;2004年02期

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1 李大祥;鮮殊;楊衛(wèi);宛曉春;;茶葉的神經保護作用研究進展[A];經濟發(fā)展方式轉變與自主創(chuàng)新——第十二屆中國科學技術協會年會（第二卷）[C];2010年

2 金昔陸;胡江元;唐放鳴;王銘潔;金國章;;四氫原小檗堿同類物抗氧化和神經保護作用[A];第七屆全國生化藥理學術討論會論文摘要集[C];2000年

3 曲方;徐濤;劉興;車鋒;何凡;陳團芝;;阿司匹林的神經保護作用[A];第九次全國神經病學學術大會論文匯編[C];2006年

4 王文;艾厚喜;張麗;孫芳林;李林;;莫諾苷神經保護作用機制研究[A];2009全國抗衰老與老年癡呆學術會議論文匯編[C];2009年

5 吳嬋姬;陸正齊;;粒細胞集落刺激因子在大鼠局灶性腦缺血損傷中的神經保護作用[A];第十一屆全國神經病學學術會議論文匯編[C];2008年

6 王文;李林;艾厚喜;安易;黃文婷;孫芳林;;莫諾苷神經保護作用機制研究[A];2008年中國藥學會學術年會暨第八屆中國藥師周論文集[C];2008年

7 李博宇;苑玉和;胡金鳳;陳乃宏;;化合物K抗帕金森神經保護作用的體外評價[A];第三屆中國藥理學會補益藥藥理專業(yè)委員會學術研討會論文集[C];2013年

8 周慧芳;王建軍;薛冰;王曉民;;雷公藤單體T_(10)的神經保護作用及機制研究[A];中國生理學會第21屆全國代表大會暨學術會議論文摘要匯編[C];2002年

9 王文;李林;艾厚喜;安易;黃文婷;孫芳林;;中藥有效成分莫諾苷神經保護作用機制研究[A];2008年全國抗衰老與老年癡呆學術會議論文集[C];2008年

10 石勝良;;ERK參與了蛇毒神經生長因子誘導的神經保護作用[A];中華醫(yī)學會第十三次全國神經病學學術會議論文匯編[C];2010年

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1 記者 白毅;新型抗炎化合物有抗炎和神經保護作用[N];中國醫(yī)藥報;2011年

2 張中橋;安定對中樞神經系統有保護作用[N];中國醫(yī)藥報;2006年

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1 Sunisa Seetapun;丹參素衍生物作為抗缺血劑在SH-SY5Y神經元性細胞和大鼠大腦上發(fā)揮的神經保護作用[D];復旦大學;2012年

2 馬磊;線粒體CB1受體的神經保護作用及機制研究[D];第四軍醫(yī)大學;2015年

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9 范佳;粒細胞集落刺激因子在急性腦缺血中的神經保護作用的研究[D];吉林大學;2005年

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1 馮帥;異丙酚對宮內窘迫胎鼠的神經保護作用及其機制探討[D];河北醫(yī)科大學;2015年

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10 孟憲珂;蓽茇酰胺類化合物的設計合成及神經保護作用研究[D];蘭州大學;2016年

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