本文關(guān)鍵詞：PCR快速鑒定皮膚癬菌病，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究目的 目前實(shí)驗(yàn)室常用的皮膚癬菌病的診斷方法為鏡檢和培養(yǎng)，該方法對(duì)操作人員的專業(yè)性要求較高，而且培養(yǎng)耗時(shí)較長，在皮膚癬菌病的快速鑒定方面，雖然國內(nèi)已有相關(guān)的分子研究報(bào)導(dǎo)，但都難以應(yīng)用于臨床。本研究通過對(duì)皮膚癬菌菌株以及臨床診斷為皮膚癬菌病患者的皮屑標(biāo)本進(jìn)行研究，將PCR方法與傳統(tǒng)診斷方法的診斷結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)對(duì)比，探索臨床皮膚癬菌病的快速簡便特異的新型診斷方法。 研究方法 第一部分使用65株皮膚癬菌臨床株以及50株非皮膚癬菌臨床株和2例人DNA用于PCR體系的優(yōu)化及CHS1(Chitin synthase1)引物的評(píng)估。采用1步法處理皮膚癬菌及非皮膚癬菌菌株獲得菌株DNA，然后用皮膚癬菌特異性引物CHS1(panDerm1:5’G A A G A A G A T T G T C G T T T G C A T C G T C T C3’,panDerm2:5’C T C GAG G T C AAAAG C AC G C C AGAG3’）對(duì)獲得的DNA產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。皮膚癬菌通用引物的敏感性測(cè)定：將獲得的菌株DNA以及人DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后跑電泳，觀察是否出現(xiàn)特定大小的陽性條帶。 PCR反應(yīng)體系的敏感性測(cè)定：用超微量分光光度計(jì)測(cè)量皮膚癬菌菌液的DNA濃度，再將皮膚癬菌菌液的DNA進(jìn)行10倍連續(xù)稀釋，獲得不同濃度的皮膚癬菌菌液，隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，記錄特定大小的陽性條帶出現(xiàn)時(shí)的最小的皮膚癬菌DNA濃度值，PCR重復(fù)3次。 第二部分，將臨床收集的119例皮屑標(biāo)本，均勻分成三份，分別進(jìn)行鏡檢、培養(yǎng)和PCR鑒定。采用Brillowska-Dabrowsk的2步提取法從臨床標(biāo)本中快速提取皮膚癬菌DNA,對(duì)臨床標(biāo)本的DNA產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，為了防止體系中PCR抑制物造成的假陰性結(jié)果，設(shè)計(jì)了IC(Internal control內(nèi)部對(duì)照)，內(nèi)部對(duì)照為大腸桿菌質(zhì)粒，該質(zhì)�？膳c皮膚癬菌CHS1特異性引物反應(yīng)，產(chǎn)生510bp的內(nèi)部對(duì)照條帶。我們?cè)O(shè)計(jì)并合成了特異性引物，其序列為For:5-G AAGAAGAT T G T C G T T T G C AT C GT C T C AG G G T T T GAT T C T G G C T C AG-3，Rev:5-C T C GAG G T C AAAA G C A C G C C AG A G G TAT TA C C G C G G C G G C T G G-3，該引物能與大腸桿菌DNA反應(yīng)，，生成510bp片段，該片段被插入大腸桿菌質(zhì)粒，合成本實(shí)驗(yàn)所需的質(zhì)粒。根據(jù)電泳結(jié)果判斷是否為皮膚癬菌感染，若電泳結(jié)果出現(xiàn)366bp的條帶，則為皮膚癬菌感染，若未出現(xiàn)此特異性條帶且出現(xiàn)了510bp的內(nèi)部對(duì)照條帶，則能判斷為非皮膚癬菌感染，若未出現(xiàn)此特異性條帶且未出現(xiàn)510bp的內(nèi)部對(duì)照條帶，則為假陰性結(jié)果。最后將臨床標(biāo)本的PCR結(jié)果與傳統(tǒng)診斷方法進(jìn)行一致性比較。 結(jié)果 第一部分：所有皮膚癬菌菌株經(jīng)PCR擴(kuò)增后均出現(xiàn)366bp的陽性條帶，非皮膚癬菌菌株及人DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后均未出現(xiàn)任何條帶。將濃度為600ng/ul的皮膚癬菌DNA濃度經(jīng)10倍連續(xù)稀釋后，得到7個(gè)濃度的菌液：600ng~6pg經(jīng)PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)366bp的陽性條帶，第8個(gè)600fg濃度經(jīng)PCR擴(kuò)增后未出現(xiàn)任何條帶。 第二部分：在119例臨床標(biāo)本中，PCR與傳統(tǒng)診斷方法的一致性檢驗(yàn)Kappa值為0.910，P0.01，兩種方法在診斷結(jié)果方面具有較高的一致性。然而PCR方法在5小時(shí)內(nèi)即可完成從標(biāo)本處理至結(jié)果判讀的全過程，且操作簡便，判斷結(jié)果客觀。 結(jié)論 皮膚癬菌通用引物CHS1具有較高的特異性，可用作檢測(cè)皮膚癬菌的特異性引物，本實(shí)驗(yàn)PCR體系的敏感度較高，為6pg。PCR在臨床標(biāo)本的皮膚癬菌檢測(cè)方面更加簡便快速，可替代現(xiàn)有皮膚癬菌病的傳統(tǒng)診斷方法。
【關(guān)鍵詞】：PCR 癬菌病 CHS1 傳統(tǒng)診斷
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R756
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• Abstract8-10
• 英文縮寫表10-11
• 前言11-17
• 參考文獻(xiàn)14-17
• 第一部分 PCR 體系敏感性及特異性測(cè)定17-25
• 實(shí)驗(yàn)材料18-19
• 實(shí)驗(yàn)菌株及人 DNA18
• 實(shí)驗(yàn)所用引物18-19
• 實(shí)驗(yàn)所用試劑19
• 實(shí)驗(yàn)所用器械19
• 實(shí)驗(yàn)方法19-21
• 菌種的復(fù)活19-20
• 沙保氏培養(yǎng)基的配置20-21
• 菌株 DNA 的提取21
• PCR 反應(yīng)21
• 不同 DNA 濃度梯度的稀釋液21
• 通用引物特異性測(cè)定21
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果21-23
• 用引物的特異性結(jié)果21-22
• PCR 體系的反應(yīng)敏感性測(cè)試22-23
• 討論23-25
• 第二部分 皮膚癬菌病傳統(tǒng)診斷方法與 PCR 方法的對(duì)比25-40
• 實(shí)驗(yàn)材料26-27
• 臨床皮屑標(biāo)本26
• 實(shí)驗(yàn)所用試劑26
• 實(shí)驗(yàn)所用引物26-27
• 實(shí)驗(yàn)所用器械27
• 實(shí)驗(yàn)方法27-29
• 皮屑的收集27
• 皮屑的分配27
• 皮屑的 DNA 提取27-28
• 內(nèi)部對(duì)照(Internal control IC)的構(gòu)建28-29
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果29-35
• 皮屑標(biāo)本的傳統(tǒng)診斷方法與 PCR 診斷方法的結(jié)果對(duì)比29-32
• 傳統(tǒng)方法與 PCR 診斷法檢出率的對(duì)比32
• 皮屑標(biāo)本的 PCR 檢測(cè)結(jié)果32-33
• 臨床標(biāo)本電泳圖33-34
• 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析34-35
• 討論35-40
• 全文小結(jié)40-42
• 參考文獻(xiàn)42-45
• 綜述45-58
• 參考文獻(xiàn)54-58
• 在讀期間發(fā)表論文和參加科研工作情況58-59
• 致謝59-60

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 高媛;陳烽烽;鄧孝廷;田淑琴;丁莉;;致病真菌PCR檢測(cè)方法的建立[J];中國畜牧獸醫(yī);2010年04期

2 徐建平;Heather Yoell;;甲真菌病概述及其診斷最新進(jìn)展(英文)[J];實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué);2012年02期

3 談燕;陳歡;趙瑾;陳江漢;;一步法快速鑒定皮膚癬菌[J];臨床軍醫(yī)雜志;2014年08期

4 楊靜;童中勝;萬U

本文編號(hào)：323099