目的:探討小干擾RNA（siRNA）抑制p21表達對低濃度過氧化氫（H₂O₂）誘導的黑素細胞提前衰老的影響,以及黑素細胞提前衰老與黑素傳遞功能間的關系。方法:p21 siRNA序列轉(zhuǎn)染黑素細胞,采用熒光顯微鏡、實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）及western blot檢測抑制效率。將正常人黑素細胞分為對照組（陰性siRNA轉(zhuǎn)染處理）、p21 siRNA組（p21 siRNA轉(zhuǎn)染處理）、陰性siRNA+H₂O₂組（陰性siRNA轉(zhuǎn)染24 h后加入400μmol/L H₂O₂處理）及p21 siRNA+H₂O₂組（p21 siRNA轉(zhuǎn)染24 h后加入400μmol/L H₂O₂處理）。采用β-半乳糖苷酶染色檢測細胞衰老;EdU細胞增殖檢測細胞增殖能力;western blot檢測各組p21和樹突調(diào)節(jié)蛋白[RhoA、Rac1及細胞分裂周期蛋白42（Cdc42）]表... 

【文章來源】：臨床皮膚科雜志. 2020,49(06)北大核心

【文章頁數(shù)】：7 頁

【部分圖文】：

黑素細胞經(jīng)p21 siRNA干擾后轉(zhuǎn)染效率（×40)

EdU細胞增殖檢測結果示p21 siRNA組黑素細胞EdU陽性細胞百分率[（20.60±0.56）%]較對照組[（18.68±0.16）%]增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。H2O2處理后，陰性siRNA+H2O2組黑素細胞增殖能力[（9.60±0.35）%]較對照組明顯降低（P<0.05);p21 siRNA+H2O2組[（14.37±0.65）%]與陰性siRNA+H2O2組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（圖3C）。提示p21 siRNA預處理可改善H2O2誘導的黑素細胞增殖能力降低。2.5 各組RhoA、Rac1及Cdc42蛋白表達水平比較

越來越多的研究表明，氧化應激在白癜風發(fā)病中起關鍵作用[1,12]。許多與氧化應激相關的進行性或非進行性慢性病變被稱為退行性疾病，這些疾病的病理已被證明是由持續(xù)的亞致死性氧化應激刺激，最終導致衰老和細胞退化[13]。因此推測持續(xù)的氧化應激下黑素細胞發(fā)生類似情況，氧化應激誘導黑素細胞衰老和退化。本課題組前期實驗結果表明，持續(xù)低濃度亞致死性（400μmol/L)H2O2誘導黑素細胞提前衰老，且刺激黑素細胞提前衰老的H2O2濃度在白癜風皮損中H2O2升高的水平范圍內(nèi)（最高10-3 mol/L)[14]。上述證據(jù)支持白癜風可能是一種退行性疾病。因此，本研究推測在白癜風發(fā)病的早期階段，H2O2可能不足以殺死黑素細胞，但通過誘導細胞衰老，干擾其活力和功能[15]。衰老細胞通常表現(xiàn)為β-半乳糖苷酶染色陽性率增加，細胞增殖能力降低和衰老相關蛋白表達水平上調(diào)（p16、p53及p21)[16]。本研究的前期實驗發(fā)現(xiàn)低濃度H2O2處理黑素細胞可以經(jīng)p53/p21途徑誘導黑素細胞提前衰老。本研究通過干擾p21表達，抑制細胞衰老，經(jīng)p21 siRNA處理，再由H2O2刺激后，與陰性siRNA+H2O2組比較，p21 siRNA+H2O2組β-半乳糖苷酶染色細胞陽性率降低、細胞增殖能力升高及衰老相關蛋白p21表達降低。提示通過轉(zhuǎn)染抑制p21表達，可以改善H2O2處理后黑素細胞的提前衰老。黑素細胞在黑素小體中合成黑素，并通過細胞骨架將黑素轉(zhuǎn)運至樹突末端，隨后將其轉(zhuǎn)移至周圍的角質(zhì)形成細胞中[17-18]。黑素細胞-角質(zhì)形成細胞的黑素轉(zhuǎn)移是色素沉著的重要過程。黑素細胞在表皮細胞中占少數(shù)，需與周圍角質(zhì)形成細胞相互接觸，因此黑素小體傳遞需要樹突的延伸，從而實現(xiàn)有效的黑素轉(zhuǎn)移[3]。黑素小體遷移過程中，黑素細胞樹突向周圍的角質(zhì)形成細胞延伸，將黑素小體傳遞至角質(zhì)形成細胞中。這種形態(tài)變化，與肌動蛋白和微管重組有關[19]。許多因素調(diào)節(jié)樹突形態(tài)和細胞骨架成分（如肌動蛋白和微管），關鍵調(diào)節(jié)因子包括Rho家族蛋白，Rho家族的小GTP酶調(diào)節(jié)許多細胞活動，包括細胞極性、胞吞作用、囊泡運輸、細胞周期調(diào)節(jié)、分化和基因轉(zhuǎn)錄[20]。其中3個小GTP酶發(fā)揮關鍵作用，包括RhoA、Rac1和Cdc42。已有研究確定RhoA誘導樹突回縮和應力纖維形成[21],Rac1介導樹突和板狀偽足形成[22-24],Cdc42誘導絲狀偽足和肌動蛋白微突形成[4,25]。另一方面，在神經(jīng)細胞和神經(jīng)源性細胞中（包括黑素細胞在內(nèi)），RhoA刺激樹突回縮，Rac1促進樹突生長和延伸，Cdc42介導樹突形成[26]。有研究報道皮損處黑素細胞樹突回縮和數(shù)目減少[27]�；顒悠诎遵帮L患者皮損邊緣黑素細胞和周圍角質(zhì)形成細胞內(nèi)的黑素小體計數(shù)顯著下降[5]。因此，推測低濃度H2O2誘導黑素細胞提前衰老，損傷黑素細胞傳遞黑素小體的功能，參與白癜風發(fā)病。本研究中通過western blot檢測樹突關鍵調(diào)節(jié)因子———RhoA、Rac1和Cdc42的表達，研究低濃度H2O2對黑素傳遞的影響，發(fā)現(xiàn)低濃度H2O2處理黑素細胞誘導樹突負性調(diào)節(jié)因子RhoA表達增高，正性調(diào)節(jié)因子Rac1和Cdc42表達降低。采用免疫熒光檢測H2O2處理前后細胞骨架結構和黑素小體分布變化，發(fā)現(xiàn)H2O2處理后，細胞骨架F-actin熒光強度減弱及細胞樹突縮短，黑素小體分布集中于胞核周圍，樹突末端分布減少。以上結果均表明，H2O2處理黑素細胞抑制樹突形成和延伸，從而抑制黑素小體轉(zhuǎn)移。為了進一步探討黑素細胞提前衰老與黑素傳遞功能間的關系，本研究應用siRNA p21小干擾序列轉(zhuǎn)染黑素細胞，抑制p21表達，抑制黑素細胞提前衰老，結果示p21 siRNA+H2O2組與陰性siRNA+H2O2組比較，RhoA表達降低，Rac1和Cdc42表達增高；免疫熒光示樹突延長及樹突黑素小體分布增多，提示H2O2誘導提前衰老的黑素細胞存在黑素小體傳遞功能障礙，黑素小體轉(zhuǎn)移至周圍的角質(zhì)形成細胞減少，從而引起色素脫失。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]低濃度過氧化氫誘導人黑素細胞提早衰老[J]. 孫利,石家綺,丁書紅,熊喜喜,李雪,魯嚴.  南京醫(yī)科大學學報(自然科學版). 2018(02)
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本文編號：3054195