【摘要】：背景:惡性黑色素瘤多發(fā)于皮膚,雖然發(fā)病率僅占所有皮膚癌的4%,但其死亡率卻占皮膚癌死亡率的80%;只有14%的轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者存活了五年,而且皮膚黑素瘤的發(fā)病率逐年增加。p53是一種常見的腫瘤抑制因子,并且由于其對細胞周期和凋亡基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控而被廣泛研究。p53限制糖酵解并驅(qū)動ETC裝配和維持所需基因的轉(zhuǎn)錄。除了線粒體活性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控之外,p53還直接作用于線粒體以通過與Bcl-2家族成員的相互作用來誘導細胞凋亡以響應應激。p53作為Bax的轉(zhuǎn)錄誘導劑,p53是DNA損傷與細胞凋亡之間的關(guān)聯(lián)。同時,p53還限制糖酵解并通過許多途徑抑制過度的核苷酸、氨基酸和脂肪酸合成,惡性黑色素瘤代謝引起了人們的關(guān)注。代謝重編程是癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移的能量基礎。UT-B是參與尿素跨膜轉(zhuǎn)運的膜通道蛋白。已有文獻報道發(fā)現(xiàn)膀胱癌中尿素通道蛋白B(urea transporter B,UT-B)的表達下降,并且隨著腫瘤惡性度增加。UT-B是膜上介導尿素快速跨膜轉(zhuǎn)運的通道蛋白,主要在腎臟表達參與尿濃縮功能,還廣泛分布于皮膚、大腦、心臟、肝臟等腎外組織。已有實驗證明改變膜上UT-B的表達會影響細胞內(nèi)外尿素的瞬時濃度,可能會導致腫瘤細胞氨基酸、糖、脂肪等的變化,從而影響細胞能量代謝。因此,人們推測UT-B可能通過黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。p53在暴露于高鹽和尿素后啟動細胞周期延遲中發(fā)揮重要作用,因此可能提供足夠的時間修復DNA損傷或啟動細胞凋亡,這可以阻止受損DNA的增殖。文獻報道UT-B基因敲除小鼠的心肌細胞發(fā)生線粒體功能障礙,能量代謝重構(gòu)。提示過表達UT-B引起的細胞凋亡可能與線粒體凋亡途徑有關(guān)。目的:瞬時轉(zhuǎn)染UT-B表達質(zhì)粒,使B16細胞中UT-B的表達上調(diào),通過體內(nèi)、體外實驗研究UT-B過表達后對黑色素瘤細胞生長的影響,并初步探討其作用機制。方法與結(jié)果:(1)人黑色素瘤組織中UT-B表達下降我們應用HE免疫組織化學染色方法,檢測人皮膚癌芯片(上海芯超公司)各組織中UT-B的表達水平。在正常皮膚組織中可見UT-B陽性表達,主要是在基底層細胞可見大量棕黃色斑片和顆粒。在芯片中的8例皮膚黑色素瘤組織中僅有少量棕色顆粒和斑片,在黑色素瘤中UT-B蛋白表達降低。我們又收集人皮膚痣和人黑色素瘤組織4例,提取RNA進行RT-PCR實驗,檢測UT-B mRNA的表達水平。結(jié)果顯示其中3例患者的黑色素瘤組織幾乎沒有UT-BmRNA的表達,另1例黑色素瘤組織中UT-B mRNA有弱表達,進一步證實了黑色素瘤發(fā)展過程中UT-B mRNA和蛋白水平都明顯下降。(2)黑色素瘤B16細胞中過表達UT-B后細胞生長受抑制、凋亡增加RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)黑色素B16細胞株中無UT-B mRNA表達。通過轉(zhuǎn)染UT-B表達質(zhì)粒,上調(diào)B16細胞中UT-B的表達水平,對照組轉(zhuǎn)染p CDNA3.1空質(zhì)粒。Western Blotting和免疫熒光檢測證實B16細胞轉(zhuǎn)染pUT-B 48h后具有較高的UT-B蛋白表達水平。流式細胞術(shù)實驗發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染UT-B表達質(zhì)粒后,相比于對照組,B16細胞出現(xiàn)G2/M期阻滯。MTT實驗證明轉(zhuǎn)染pUT-B 48h后,B16細胞的生長活力下降(下降到對照組的32.4%),劃痕實驗表明過表達UT-B后的B16細胞的遷移能力也明顯下降4倍左右,并且克隆形成實驗顯示B16細胞的克隆形成能力下降。以上結(jié)果說明過表達UT-B抑制了B16細胞的生長和增殖。Annexin V/PI染色后應用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染UT-B表達質(zhì)粒后,相比于對照組(6.85%±1.24%),B16細胞凋亡明顯增加(11.63%±1.67%,p0.05)。Hoechst染色顯示過表達UT-B的B16細胞中核固縮和核碎片狀增加,凋亡小體增多(p0.05),也證明細胞凋亡增加。另外,Western Blotting實驗表明促凋亡蛋白Bax和Cleaved-Caspase3的表達水平增加(p0.05),抑凋亡蛋白Bcl2的蛋白表達水平下降(p0.05),說明過表達UT-B后促進了B16細胞凋亡。(3)黑色素瘤B16細胞中過表達UT-B后可能通過激活p53、線粒體損傷誘導細胞凋亡據(jù)報道UT-B基因敲除小鼠的心肌細胞中線粒體功能障礙,提示UT-B表達水平的變化極可能影響線粒體功能。DCFH-DA熒光探針染色后應用流式細胞術(shù)檢測細胞ROS水平,結(jié)果顯示UT-B表達48h后,B16細胞中ROS產(chǎn)生增多(比對照組增加18.7%,p0.05),線粒體膜電勢下降(p0.05),而細胞耗氧量明顯下降(降低到對照組的54.8%,p0.05)。同時Western Blotting檢測發(fā)現(xiàn)過表達UT-B的細胞中線粒體電子傳遞鏈中復合體I,III,IV和V的相關(guān)重要亞基NDUFV1,CYC1,COX7C和ATP5F1的表達水平明顯下降(p0.05),清除氧自由基相關(guān)酶SOD2的表達水平也明顯下降(p0.05),CYC1從線粒體釋放至胞質(zhì)明顯增加。以上說明UT-B過表達后B16細胞線粒體功能下降,從而啟動線粒體凋亡途徑來誘導細胞凋亡。在UT-B基因敲除小鼠中膀胱上皮細胞的線粒體損傷是p53依賴性的,本研究也調(diào)查了黑色素瘤中過表達UT-B是否也是與p53有關(guān)。應用Western Blotting發(fā)現(xiàn)過表達UT-B上調(diào)了B16細胞中p53和下游p21的表達。AKT的激活促進MDM2的核進入,降低p53的細胞水平。本研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染UT-B表達質(zhì)粒后p-AKT的表達水平下調(diào),與之相對應MDM2表達下調(diào)(p0.05)。以上說明轉(zhuǎn)染UT-B表達質(zhì)粒抑制B16細胞增殖可能通過激活p53和線粒體途徑誘導了細胞凋亡。(4)脂代謝相關(guān)酶的表達和糖攝取在B16細胞中,在過表達UT-B后,Western Blotting檢測發(fā)現(xiàn)葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白GLUT1的表達降低,并且分光光度計法檢測發(fā)現(xiàn)葡萄糖攝取減少。RT-PCR實驗檢測發(fā)現(xiàn)脂肪合成關(guān)鍵酶FASN,SREBP1的mRNA的表達降低。以上結(jié)果說明在B16細胞中過表達UT-B可能會影響細胞糖代謝和脂代謝。(5)在小鼠黑色素瘤移植瘤中UT-B過表達也明顯抑制腫瘤生長,可能與p53途徑有關(guān)構(gòu)建小鼠黑色素瘤移植瘤模型,將小鼠分成PQ組、PQ-P(PQ-p CDNA3.1)組和PQ-U(PQ-UT-B)組。以具有腫瘤靶向性的減毒沙門氏菌作為運載體,攜帶p CDNA3.1和pUT-B,以尾靜脈注射的方式給予小鼠,觀察腫瘤生長情況和小鼠生長狀態(tài)。結(jié)果顯示PQ-U組腫瘤中UT-B的表達水平高于對照組PQ組和PQ-P組。腫瘤中過表達UT-B進行治療(14天),腫瘤體積增長速率和重量都較對照組明顯降低,說明過表達UT-B抑制了黑色素瘤生長。同時Western Blotting檢測到腫瘤細胞中BAX上調(diào),Bcl2下調(diào)。過表達UT-B增加了p53和p21的表達水平,降低了Mmd2和p-AKT的表達水平。結(jié)論:1、與人正常皮膚相比,人黑色素瘤組織中具有較低的UT-B表達水平,推測改變UT-B表達可能會影響黑素瘤細胞的增殖和生長。2、UT-B能誘導B16細胞中促凋亡蛋白BAX和Cleaved-Caspase3表達顯著升高,同時還低表達抑凋亡蛋白Bcl2。表明UT-B具有促進B16細胞凋亡,抑制其生長和增殖的作用。3、UT-B能誘導B16細胞中線粒體膜電位下降,線粒體中細胞色素C表達減少,細胞中細胞色素C表達增多,表明UT-B可能是通過線粒體途徑促進細胞凋亡。4、UT-B能誘導葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白Glut1表達減少,抑制細胞內(nèi)葡萄糖的攝取,并降低脂肪酸合成酶關(guān)鍵酶的表達,表明UT-B對細胞的抑制作用可能與代謝抑制有關(guān)。5、UT-B能抑制磷酸化AKT表達,通過p53的負調(diào)控因子MDM2激活p53,p53,來抑制糖代謝與脂代謝和誘導線粒體途徑凋亡,抑制黑色素瘤B16細胞生長。綜上所述,B16細胞中上調(diào)UT-B表達水平后,通過激活p53,來抑制糖代謝與脂代謝和誘導線粒體途徑凋亡抑制黑色素瘤B16細胞生長和增殖,促進其死亡。我們已經(jīng)證實了UT-B在皮膚黑素瘤發(fā)展中的作用,為黑色素瘤的治療提供新的策略。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R739.5

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本文編號：2783160