【摘要】： 流行病學研究表明低濃度砷劑的暴露與皮膚癌等各種腫瘤的發(fā)生有關。砷劑雖然被公認為是人類的致癌劑之一,但是其致癌作用機制仍存在爭論。有的學者認為砷劑可單獨引起腫瘤的發(fā)生,而有的學者認為砷劑只是協(xié)同其它致癌物導致正常細胞的惡性轉化。p53基因是已知的抑癌基因之一,其介導的信號傳導途徑在細胞的增殖分化、應激和癌變等生命過程中起著極其重要的作用,被稱為“基因組衛(wèi)士”。鼠雙微粒體2(murine double minute2,MDM2)基因是p53的下游基因之一,p53可激活MDM2轉錄,MDM2反過來又抑制p53的功能,二者形成自動調節(jié)反饋環(huán),以保持正常情況下p53處于低水平狀態(tài)。正確的亞細胞定位對于p53的功能活性十分重要,p53被激活后進入胞核內,激活其靶基因的轉錄,之后回到胞漿中被降解。MDM2由于具有核輸出序列(NES)和核定位序列(NLS)而具有核漿穿梭能力,NES使MDM2由胞核到胞漿而NLS使之由胞漿到胞核。MDM2蛋白可把p53/MDM2復合物直接運出細胞核,MDM2的核漿穿梭能力對其抑制p53的功能活性非常重要。本課題研究中,我們以hTERT永生化的皮膚角質形成細胞為研究對象,探討了砷劑對皮膚角質形成細胞p53功能的影響及MDM2在其中所起的作用機制,為闡明砷劑引起皮膚癌的機理提供新的實驗依據(jù)。 第一章低濃度砷劑經(jīng)由上調MDM2介導p53胞漿分布所致功能失活 目的:探討低濃度砷劑對人皮膚角質形成細胞中MDM2蛋白的影響及其與p53的亞細胞分布狀態(tài)和功能的關系。 方法:以hTERT永生化的皮膚角質形成細胞為研究對象。采用蛋白印跡法(Western blotting)研究0.5μmol/L、1μmol/L和2μmol/L亞砷酸鈉處理12小時和24小時后MDM2、p53和絲氨酸15位磷酸化的p53蛋白的表達水平,并且與5-Fu和紫外線處理作比較。采用細胞免疫熒光染色法研究砷劑處理前后p53蛋白的亞細胞定位及細霉素B和Nutlin-3預處理對其影響。 結果:低濃度砷劑上調了角質形成細胞中MDM2蛋白的表達,但對p53蛋白表達無明顯影響。隨著低濃度砷劑劑量的逐漸增加,MDM2蛋白的表達水平亦逐漸增加;隨著砷劑作用時間的逐漸增加,MDM2蛋白的表達水平也逐漸增強。低濃度砷劑處理后角質形成細胞p53蛋白主要分布在胞漿。細霉素B和Nutlin-3預處理可以阻斷砷劑誘導的p53胞漿分布。先用低濃度砷劑處理角質形成細胞后再加5-Fu刺激,此時5-Fu激活p53功能受到明顯的抑制。 結論:低濃度砷劑呈劑量和時間依賴性上調角質形成細胞中MDM2蛋白的表達;低濃度砷劑可經(jīng)由上調MDM2蛋白表達介導p53的胞漿分布;低濃度砷劑誘導的p53胞漿分布導致p53功能性失活。 第二章低濃度砷劑上調MDM2的機制探討 目的:探討低濃度砷劑上調MDM2表達的作用機制。 方法:構建pGL3-MDM2基因啟動子報告基因表達載體,采用熒光素酶報告基因分析方法觀察亞砷酸鈉對MDM2基因P1、P2啟動子轉錄活性的影響。應用1μmol/L和2μmol/L亞砷酸鈉處理皮膚角質形成細胞24h后采用逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)方法檢測MDM2 mRNA的表達水平。應用PD98059、SB203580和LY294002等特異性信號轉導通路抑制劑預處理后再觀察砷劑對角質形成細胞MDM2表達的影響。 結果:低濃度砷劑可顯著誘導MDM2基因P1啟動子的熒光素酶活性(P＜0.05)。隨著低濃度砷劑的劑量逐漸增加,MDM2 mRNA的表達水平逐漸增高。PD98059預處理可完全阻斷砷劑上調角質形成細胞中MDM2的表達,而SB203580和LY294002預處理對砷劑誘導的MDM2表達上調無明顯影響。 結論:通過MAPK/ERK信號轉導通路,低濃度砷劑激活MDM2基因P1啟動子的轉錄活性,從而誘導MDM2的表達。 第三章低濃度砷劑通過功能性失活p53發(fā)揮輔助致癌作用 目的:探討低濃度砷劑對紫外線引起角質形成細胞凋亡的影響及其與砷性皮膚癌作用機制的關系。 方法:應用0.5μmol/L和1μmol/L亞砷酸鈉處理角質形成細胞24h后,再用40mJ/cm~2紫外線照射。采用流式細胞術和Hoechst33258胞核染色檢測砷劑和UV引起的細胞凋亡。 結果:0.5μmol/L和1μmol/L砷劑處理角質形成細胞后凋亡率分別為1.2%和1.5%,與正常對照組1.5%無顯著性差異(P＞0.05)。而先經(jīng)過0.5μmol/L和1μmol/L砷劑預處理后的角質形成細胞再照射紫外線,此時凋亡率分別為48.8%和39.9%,與未經(jīng)砷劑預處理直接照射UV組凋亡率64.7%相比有顯著性差異(P＜0.05)。表明砷劑預處理可導致角質形成細胞對UV的凋亡抗性。Hoechst33258核染色結果與之相一致。 結論:低濃度砷劑暴露可損害皮膚角質形成細胞對紫外線引起的凋亡反應;低濃度砷劑可通過功能性失活p53從而發(fā)揮其輔助致癌作用。
【圖文】：

1.3.1低濃度砷劑上調角質形成細胞MDMZ蛋白的表達但對p53蛋白表達無明顯影響如圖I一1所示，lunil幾亞砷酸鈉處理皮膚角質形成細胞后 westemblotting結果顯示MDMZ蛋白明顯上調，但p53蛋白的表達無明顯差異;且反映p53功能活化的絲氨酸巧位磷酸化的p53蛋白沒有出現(xiàn)。然而，5一Fu和UV處理角質形成細胞后，不僅出現(xiàn)MDMZ蛋白的表達上調，而且也出現(xiàn)p53蛋白的上調;絲氨酸巧位磷酸化的p53蛋白的出現(xiàn)表明5一Fu和UV處理激活了P53蛋白的功能。IB:MDMZIB:P53業(yè)r15IB:P53IB:p·actin CNaAsO25· FuUV圖I一l砷劑對角質形成細胞MDMZ、p53和絲氛酸巧位磷酸化的p53蛋白的影響泳道1:正常對照;泳道2:砷劑處理組;泳道3:5一Fu處理組;泳道4:UV處理組。 1.3.2砷劑上調角質形成細胞中MOMZ蛋白呈現(xiàn)劑量和時間依賴性1.3:21砷劑上調角質形成細胞中MDMZ蛋白的劑量反應效應如圖I一2所示，隨著砷劑的劑量逐漸增大，，角質形成細胞中MDMZ蛋白的表達水平亦逐漸增強，呈現(xiàn)明顯的劑量反應依賴性(P<0.05)。

Beta一actinN叭 502(pmol幾): 00.5圖I一2不同劑量砷劑對角質形成細胞MDMZ蛋白影響泳道1:正常對照組;泳道 2:0.5拼mo比砷劑處理24h;泳道3:1卜mof幾砷劑處理24h;泳道4:2林m。比砷劑處理24h。1.3.2.2砷劑上調MDMZ蛋白的時間反應效應如圖I一3所示，同樣是Zpmol幾砷劑處理，白表達逐漸增強，呈現(xiàn)明顯的時間反應依賴性·隨著處理時間延長，MDMZ蛋 (P<0.05)。{{{耀瓢薰馨馨 馨:MDMZ哪娜弊嘿攀拼~月IB:p一actin C12h24h圖I一3砷劑不同處理時間對角質形成細胞Ml)MZ蛋白的影響泳道卜正常對照組;泳道2:2林mof幾砷劑處理12h;泳道3:2件mol幾砷劑處理24h。 1.3.3MDMZ上調介導砷劑誘導人角質形成細胞p53胞槳再分布1.3.3.1低濃度砷劑處理前后p53的亞細胞定位從圖I一4我們可以看出，5一Fu處理后皮膚角質形成細胞中p53蛋白聚集在胞核內，且其表達增強。與之不同的是，砷劑處理角質形成細胞后，p53蛋白主要分布在胞漿。
【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R751

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