本文關(guān)鍵詞：人表皮和毛囊的細(xì)胞培養(yǎng)及黑素細(xì)胞重編程的研究　出處：《蚌埠醫(yī)學(xué)院》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的:(1)觀察表皮細(xì)胞在三種培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀況,檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)上清中內(nèi)皮素-1(Endothelin-1,ET-1)和干細(xì)胞因子(Stem cell factor,SCF)的水平;(2)連續(xù)觀察成人頭皮毛囊外根鞘(Outer root sheath,ORS)和毛乳頭(Dermal papilla,DP)細(xì)胞的生長(zhǎng)及形態(tài)學(xué)變化;(3)采用3個(gè)因子轉(zhuǎn)染人表皮黑素細(xì)胞(melanocytes,MCs)成為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells,i PSCs)。方法:(1)采用3種培養(yǎng)基培養(yǎng)表皮細(xì)胞,分別在培養(yǎng)24h、48h、72h、96h時(shí)收集培養(yǎng)上清,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法檢測(cè)ET-1和SCF水平,同時(shí)比較不同培養(yǎng)基中細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài);(2)利用兩步酶消化獲得正常人頭皮毛囊的ORS和DP,采用添加人角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)添加物(human keratinocyte growth supplement,HKGS)和人黑素細(xì)胞生長(zhǎng)添加物(human melanocyte growth supplement,HMGS)的K-SFM進(jìn)行體外培養(yǎng),倒置顯微鏡下連續(xù)觀察毛囊ORS和DP的遷移和生長(zhǎng);(3)用分別攜帶Oct4、Klf-4和c-Myc因子的慢病毒載體轉(zhuǎn)染人表皮MCs,對(duì)生成的克隆進(jìn)行堿性磷酸酶染色(AP)、甲基化水平檢測(cè)、干細(xì)胞標(biāo)記相關(guān)抗體的免疫熒光染色、透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)、體外誘導(dǎo)三胚層分化。結(jié)果(1)三組培養(yǎng)上清中,培養(yǎng)基2(M2)中上清ET-1的含量最高;隨著時(shí)間延長(zhǎng)ET-1含量均增加,三組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);三組培養(yǎng)上清中SCF含量在第24~48小時(shí)含量顯著下降,三者之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。換液后ET-1和SCF變化趨勢(shì)基本同換液前(P0.01)。M2中細(xì)胞增殖最快,角質(zhì)形成細(xì)胞(keraticytes,KCs)呈集落樣生長(zhǎng),MC的樹突較多。培養(yǎng)基1(M1)中貼壁細(xì)胞數(shù)目少,死亡細(xì)胞多,細(xì)胞增殖緩慢,KCs散在,MCs多是雙極。培養(yǎng)基3(M3)細(xì)胞生長(zhǎng)情況介于M1和M2兩組之間;(2)將單個(gè)毛囊置于預(yù)先涂布血清的培養(yǎng)板2小時(shí),然后添加少量培養(yǎng)基,毛囊粘附于培養(yǎng)板的幾率增加,數(shù)小時(shí)后,即可見細(xì)胞從ORS及DP處遷移生長(zhǎng),以KCs、成纖維細(xì)胞(fibroblasts,FBs)為主,MCs較少。并且,ORS和DP的遷出和生長(zhǎng)有明顯不同。如果培養(yǎng)基過多,則多數(shù)毛囊懸浮,無細(xì)胞遷出,最終死亡。(3)采用攜帶Oct4、Klf-4和c-Myc因子的3個(gè)慢病毒載體轉(zhuǎn)染人表皮MCs,轉(zhuǎn)染后第6天,開始形成克隆。第1代和第3代i PSCs的AP染色為陽性;與母本相比,Oct4和Nanog基因位點(diǎn)部分去甲基化,透射電鏡觀察可見細(xì)胞增生活躍,部分細(xì)胞中有3個(gè)核仁,極少數(shù)細(xì)胞的細(xì)胞漿中可見散在I和II期黑素體。將第5代i PSCs懸浮培養(yǎng)獲得擬胚體,后者貼壁培養(yǎng)后,干細(xì)胞相關(guān)抗體染色顯示Sox2陽性、Cdy1強(qiáng)陽性。用第5代克隆進(jìn)行誘導(dǎo)分化,在分化后2周,顯示代表脂肪細(xì)胞的油紅染色陽性,代表肝細(xì)胞的白蛋白染色陽性,但代表神經(jīng)元標(biāo)記的相關(guān)染色陰性。結(jié)論:(1)培養(yǎng)基中高水平ET-1有利于表皮細(xì)胞的貼壁、增殖和分化。在培養(yǎng)過程中表皮細(xì)胞能夠分泌ET-1,并釋放入培養(yǎng)上清。表皮細(xì)胞培養(yǎng)消耗SCF,但無明顯表皮分泌作用。(2)預(yù)先涂布血清和開始僅添加少量培養(yǎng)基,有利于毛囊粘附,隨后細(xì)胞遷移生長(zhǎng)。(3)攜帶3個(gè)因子的慢病毒轉(zhuǎn)染人表皮MCs,可以產(chǎn)生不完全型的i PSCs,表達(dá)大部分干細(xì)胞的性能,體外也能誘導(dǎo)成脂肪細(xì)胞、肝臟細(xì)胞,但沒有成功誘導(dǎo)成神經(jīng)元細(xì)胞。
【學(xué)位授予單位】：蚌埠醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R758.7

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