研究背景系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)是一種在黃種人群中高發(fā)的典型自身免疫性疾病之一,通常情況下,患者的免疫細(xì)胞異�；罨�,產(chǎn)生大量自身抗體與免疫復(fù)合物,各種細(xì)胞免疫應(yīng)答功能紊亂,最終導(dǎo)致全身多器官系統(tǒng)受損。SLE的的癥狀多種多樣,主要累及皮膚黏膜、腎、血液系統(tǒng)、關(guān)節(jié)和神經(jīng)等多種器官。以往的研究多偏向于SLE與遺傳,表觀遺傳等基因組學(xué)研究,然而目前研究結(jié)果揭示SLE的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)化與非編碼RNA(包括IncRNA和miRNA等)有顯著的相關(guān)性,環(huán)狀RNA也是非編碼RNA家族中的一員,雖然它早就被發(fā)現(xiàn),但是一直沒有被真正深入的研究,近年來,它因自身的一系列突出特點(diǎn)——如半衰期長(zhǎng)、組織特異性明顯等成為近年來的明星分子,但是SLE與環(huán)狀RNA的關(guān)聯(lián)僅有寥寥數(shù)篇文章,且缺乏第三代測(cè)序技術(shù)(RNA-seq)在SLE患者與正常人PBMCs中的研究。目的借助RNA-seq技術(shù)了解環(huán)狀RNA在SLE患者與正常人PBMCs中的表達(dá)情況,初步篩選可能作為紅斑狼瘡生物標(biāo)志物的分子,并進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。選其中數(shù)據(jù)最良好的一個(gè)(circ-PTPN22)初步探討其可能的作用機(jī)制。方法本課題采用病例對(duì)照設(shè)計(jì),收集未經(jīng)過治療的新發(fā)SLE患者4例,和3例健康對(duì)照,利用RNA-seq技術(shù)初步篩選出128種差異化表達(dá)的circRNA(log2FC≥1.0),選取其中2種上調(diào)circRNA(circ-LRRK2、circ-PPHLN1)和2種下調(diào)circRNA(circ-PTPN22、circ-MYBL1)做大樣本量RT-qPCR(Real-time Quantitative polymerase chain reaction)驗(yàn)證(49例SLE患者與37例健康對(duì)照),再選取差異較為明顯的circRNA-circPTPN22做進(jìn)一步分析(桑格測(cè)序,SLEDAI指數(shù)相關(guān)性,治療前后對(duì)比,ROC曲線等),并預(yù)測(cè)circPTPN22可能的生物學(xué)功能,如靶向miRNA結(jié)合功能,ORF框預(yù)測(cè),IRES結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè),可能翻譯的蛋白質(zhì)序列預(yù)測(cè)等。隨即用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建過表達(dá)circPTPN22的載體質(zhì)粒,將質(zhì)粒電穿孔轉(zhuǎn)染jurkat細(xì)胞,用免疫印跡試驗(yàn)(western blot,WB)證實(shí)了其能夠翻譯蛋白質(zhì),并預(yù)測(cè)了circPTPN22及其翻譯的小蛋白可能的功能作用。結(jié)果本研究借助RNA-seq技術(shù)初步篩選出128個(gè)在SLE患者和健康對(duì)照組PBMCs中差異表達(dá)的環(huán)狀RNA(log2FC≥1.0),包括89種上調(diào)circRNA與39種下調(diào)circRNA,部分測(cè)出的circRNA未被circbase網(wǎng)站收錄。篩選出的4種circRNA(circ-LRRK2、circ-PPHLN1、circ-PTPN22、circ-MYBL1)的RT-qPCR趨勢(shì)均與RNA-seq結(jié)果相符。Circ-PTPN22進(jìn)一步分析提示,circPTPN22與病人的SLEDAI指數(shù)呈明顯的負(fù)相關(guān)性,即病人的SLEDAI評(píng)分越高,circPTPN22的表達(dá)越低。在病人治療前后的對(duì)比中,治療后的病人circPTPN22的表達(dá)較治療前明顯上升。ROC曲線圖提示circPTPN22的曲線下面積(AUC)為0.918,提示circPTPN22具有較好的診斷價(jià)值。進(jìn)一步生物學(xué)分析表明,circPTPN22可結(jié)合多種miRNA,這些miRNA的靶基因,如CD28,IL7等多與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)。此外,circPTPN22還具有IRES位點(diǎn)以及多個(gè)ORF框,預(yù)測(cè)具有蛋白質(zhì)翻譯活性。構(gòu)建過表達(dá)circPTPN22載體,電轉(zhuǎn)染jurkat細(xì)胞,WB結(jié)果顯示,circPTPN22的確能翻譯出蛋白質(zhì)。結(jié)論本次研究發(fā)現(xiàn)了128個(gè)在健康人與初發(fā)SLE患者PBMCs內(nèi)差異表達(dá)的circRNA,證實(shí)了circPTPN22、circMYBL1在SLE患者體內(nèi)表達(dá)較低,circ-LRRK2、circ-PPHLN1在SLE患者體內(nèi)表達(dá)升高。證明了circPTPN22的確存在,并具有優(yōu)良的SLE病情判斷能力,有望成為新的SLE活動(dòng)標(biāo)志物。證實(shí)了circPTPN22確實(shí)可以翻譯蛋白質(zhì)(circPTPN22-pro)。并進(jìn)一步預(yù)測(cè)了circPTPN22和新蛋白circPTPN22-pro的功能作用。
【學(xué)位單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R593.241
【部分圖文】：

28 SLE 患者和健康對(duì)組 circRNA 表達(dá)譜的鑒定形圖顯示了各個(gè)樣本歸 化（標(biāo)準(zhǔn)化）后近似相等的分布。點(diǎn)圖，可將 SLE 組與對(duì)照組 circRNA 的表達(dá)差異可視化。紅色和綠色圓

圖 2 SLE 患者與健康對(duì)照組間異常環(huán)狀 rna 的生物信息學(xué)分析。(A)128 個(gè)差異表達(dá)的 circRNA 來源的染色體的位置分布。(B)SLE 組與正常組之間環(huán)狀 rna-mirna-mrna 網(wǎng)絡(luò)的 KEGG 通路分析。y 軸代表最顯著富集的通路名稱，x 軸代表通路的得分(P 值的負(fù)對(duì)數(shù))。上圖為上調(diào)的 circRNAs;下圖為下調(diào)的 circRNAs。Fig. 2. Computational bioinformatics analysis of aberrant circRNAs betweenpatients with SLE and healthy controls.(A) The differentially expressed circRNAs and the distributions of their chromosomallocations. (B) KEGG analysis of the circRNA-miRNA-mRNAs network between theSLE and normal groups. The y-axis represents the most significantly enriched pathways,and the x-axis represents their scores (negative logarithm of P value). Up, upregulatedcircRNAs; down, downregulated circRNAs.

圖 3 SLE 患者和正常人 PBMC 中各環(huán)狀 RNA 的表達(dá)情況(A) 49 例 SLE 患者和 37 例健康對(duì)照組 pbmc 中 circLRRK2 的表達(dá)。(B) 49 例 SLE 患者和 37 例健康對(duì)照組 pbmc 中 circPPHLN1 的表達(dá)。(C) 49 例 SLE 患者和 37 例健康對(duì)照組 pbmc 中 circPTPN22 的表達(dá)。(D) 49 例 SLE 患者和 37 例健康對(duì)照組 pbmc 中 circMYBL1 的表達(dá)。Fig.3 Expression of various circRNAs in PBMC of SLE patients and normal people(A)Expression of circLRRK2 in PBMCs from 49 patients with SLE and 37 healthycontrols. (B)Expression of circPPHLN1 in PBMCs from 49 patients with SLE and 37healthy controls. (C)Expression of circPTPN22 in PBMCs from 49 patients with SLEand 37 healthy controls. (D)Expression of circMYBL1 in PBMCs from 49 patientswith SLE and 37 healthy controls.
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本文編號(hào)：2844039