背景肥胖是一種以身體脂肪含量過多和/或分布異常,常伴有體質(zhì)量增加為重要特征的多病因慢性病。近年來,隨著生活水平的提高,肥胖人群逐年增長,肥胖癥已成為世界范圍的流行病。最新肥胖流行病學研究顯示,全球男性和女性肥胖人口分別增長至2.66億和3.75億,而中國的肥胖人群數(shù)目已近9000萬,位居世界首位。同時,肥胖可導致高胰島素血癥,二者互為因果,形成惡性循環(huán)。雖然科學界在19世紀就已提出腦組織在葡萄糖穩(wěn)態(tài)中起主導作用,但隨著胰島素的發(fā)現(xiàn),整個20世紀國內(nèi)外研究主要集中于胰島在維持血糖穩(wěn)態(tài)中的作用,掩蓋了腦作為關(guān)鍵點調(diào)控血糖穩(wěn)態(tài)的地位。國外研究顯示,將對外周組織無任何影響的低劑量瘦素直接注射入胰島素缺乏動物的腦室中,發(fā)現(xiàn)中樞瘦素仍可使糖尿病動物模型的血糖正�；�。這驚人的結(jié)論與以胰島為中心的葡萄糖穩(wěn)態(tài)模式不符。提示我們,外周能量代謝及葡萄糖穩(wěn)態(tài)的維持除了直接受到外周代謝器官的影響外,中樞神經(jīng)系統(tǒng)及中樞能量調(diào)控因子發(fā)揮的作用也不容小覷。下丘腦黑皮質(zhì)素受體4(MC4R)屬于七次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體,是中樞黑皮質(zhì)素通路的重要組成部分。MC4R通過與其內(nèi)源性激動劑α-促黑素細胞激素(α-MSH)及內(nèi)源性拮抗劑刺鼠相關(guān)蛋白(AgRP)相互作用而發(fā)揮調(diào)節(jié)食欲和能量代謝的作用。已有研究指出,MC4R是哺乳動物能量穩(wěn)態(tài)和體重的關(guān)鍵調(diào)節(jié)子,能夠感知和整合外界刺激信號,調(diào)節(jié)食欲、自主神經(jīng)及神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的活性從而控制能量代謝。而MC4R雜合突變是人類單基因肥胖最常見的病因。且本課題組前期研究表明,大腦MC4R的活化可改善糖尿病動物模型中骨骼肌線粒體的功能損傷,糾正線粒體氧化應激。另有研究指出,敲除MC4R的大鼠表現(xiàn)出血清脂類濃度明顯升高、內(nèi)臟白色脂肪組織重量增加、脂肪細胞數(shù)量增多以及糖耐量受損。綜上,腦部MC4R在外周能量代謝中發(fā)揮至關(guān)重要作用。然而,MC4R僅僅為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元表面的跨膜受體,無法直接作用于外周。因此,我們推測,MC4R對外周代謝器官的影響可能借助于某些中間介質(zhì)而發(fā)揮調(diào)控作用。高通量測序技術(shù),又稱為第二代測序技術(shù),以能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定和一般讀長較短等為標志。其中,轉(zhuǎn)錄組測序可檢測特定細胞在某一功能狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出的所有mRNA的總和。可以整體水平研究基因功能及基因結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)不同生理或者病理狀態(tài)下細胞、組織或個體內(nèi)差異表達的基因。因此,我們擬通過高通量測序技術(shù)篩選MC4R過表達細胞中差異表達的mRNAs,并進行生物信息學分析及初步機制探索,為下一步深入研究中樞MC4R與外周代謝器官的能量消耗及糖代謝的具體機制奠定基礎(chǔ)。目的本研究擬構(gòu)建MC4R過表達腺病毒載體并轉(zhuǎn)染小鼠下丘腦GnRH神經(jīng)元細胞(GT1-7細胞),采用高通量測序技術(shù),篩選MC4R下游差異表達基因。并使用實時熒光定量PCR、Western Blot對部分差異表達mRNAs進行驗證,初步探討MC4R影響外周能量代謝及胰島素敏感性的新靶點,以期有利于探尋與肥胖相關(guān)的以腦為中心的新的代謝通路,為靶向糾正肥胖及胰島素抵抗相關(guān)疾病奠定堅實的理論基礎(chǔ)。方法培養(yǎng)小鼠下丘腦GnRH神經(jīng)元細胞(GT1-7細胞)。構(gòu)建MC4R過表達腺病毒載體,并轉(zhuǎn)染小鼠下丘腦GT1-7細胞。采用高通量測序技術(shù),檢測MC4R過表達組(n=3)與對照組(n=3)GT1-7細胞內(nèi)差異表達的mRNAs,構(gòu)建差異表達譜。對差異mRNAs進行GO分析、KEGG Pathway分析,篩選出能量代謝、內(nèi)分泌及代謝疾病等代謝通路及相關(guān)差異表達mRNAs。此外,構(gòu)建MC4R過表達、干擾表達腺病毒載體,并轉(zhuǎn)染小鼠下丘腦GT1-7細胞。采用實時熒光定量PCR及Western Blot方法驗證MC4R過表達組、MC4R干擾組及對照組中MC4R與篩選出的部分差異基因的表達情況,并對MC4R通過何種下游通路調(diào)控外周能量代謝的機制進行初步探討。結(jié)果1.高通量測序結(jié)果顯示,MC4R過表達組GT1-7細胞與對照組GT1-7細胞相比,表達變化的mRNAs共有近千條。其中表達上調(diào)的mRNAs有629條,表達下調(diào)的mRNAs有260條,且變化倍數(shù)均大于2倍(Q0.001)。2.對差異表達的mRNAs進行GO分析顯示,生物學過程主要集中在生物學調(diào)節(jié)、細胞過程、細胞成分組織或生物發(fā)生、發(fā)育過程、代謝過程、刺激反應、信號通路等過程;分子功能主要集中在分子結(jié)合、催化活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子活性、轉(zhuǎn)運蛋白活性、信號轉(zhuǎn)導蛋白活性、分子功能調(diào)節(jié)因子等方面。KEGG Pathway分析顯示,基因調(diào)控主要集中在內(nèi)分泌和代謝疾病、環(huán)境適應性調(diào)節(jié)、感染性疾病、能量代謝、脂質(zhì)代謝、聚糖合成及代謝、cAMP通路、鈣信號通路、cGMP-PKG通路、細胞轉(zhuǎn)運和分解等代謝途徑。3.實時熒光定量PCR及Western Blot驗證部分差異表達的mRNAs,結(jié)果顯示:MC4R過表達組中MC4R、ADCY3、AGT mRNA及蛋白均表達上調(diào),MC4R干擾組則相反。而與ADCY3、AGT的表達情況相反,MC4R過表達組的HCRT mRNA及蛋白均表達下調(diào),MC4R干擾組的HCRT mRNA及蛋白均表達升高。結(jié)論1.在MC4R過表達的下丘腦GT1-7細胞中,涉及內(nèi)分泌和代謝疾病、環(huán)境適應性調(diào)節(jié)、能量代謝、信號轉(zhuǎn)導等通路的基因表達譜發(fā)生了顯著變化。2.下丘腦GT1-7細胞中MC4R受到活化后可增加下游ADCY3、AGT分子的表達,從而直接或間接發(fā)揮能量調(diào)節(jié)作用。
【學位單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R589.2
【部分圖文】：

圖 1.1 pDC316-mCMV-EGFP 載體質(zhì)粒圖.2.2 目的基因的準備1) 引物設(shè)計C316-MC4R-F：CGGGCCCTCTAGACTCGAGCGGCCGCATGAACTCCACCACCATC316-MC4R-R：GCTGATCAGCGGTTTAAACTTAAGCTTTTAATACCTGCAAC2) MC4R 基因MC4R 基因合成于蘇州金維智生物技術(shù)有限公司，將其連接在已制備的 pDC316-mCMV-EGFP 上，連接的酶切位點分別是 Not I 和 Hind III。3) PCR 反應擴增目的基因以合成的 MC4R 基因為模板，進行 PCR 反應擴增，擴增體系如下：

圖 1.2 mRNA 文庫構(gòu)建流程圖分析流程的數(shù)據(jù)稱為 raw reads 或 raw data，隨后要對 raw r測序數(shù)據(jù)是否適用于后續(xù)分析。質(zhì)控后，經(jīng)過濾得到列。比對完，通過統(tǒng)計比對率、reads 在參考序列上的是否通過第二次質(zhì)控(QC of alignment)。若通過，則因表達水平的各項分析（主成分、相關(guān)性、差異基因樣品間差異表達基因，進行 GO 功能顯著性富集分析、聚類、蛋白互作網(wǎng)絡(luò)和轉(zhuǎn)錄因子等更深入的挖掘分

15圖 1.3 信息分析流程圖.4 數(shù)據(jù)過濾測序的原始數(shù)據(jù)包含低質(zhì)量、接頭污染以及未知堿基 N 含量過高的 re分析之前需要去除這些 reads 以保證結(jié)果的可靠性。過濾后 reads 的質(zhì)過濾后 reads 質(zhì)量統(tǒng)計表，原始數(shù)據(jù)過濾成分統(tǒng)計圖，堿基含量分布以布見 Clean reads 堿基含量分布圖和 Clean reads 的堿基質(zhì)量分布圖。本軟件 SOAPnuke 進行過濾，具體步驟如下：1) 去除包含接頭的 reads（接頭污染）；2) 去除未知堿基 N 含量大于 5%的 reads；3) 去除低質(zhì)量的 reads (我們定義質(zhì)量值低于 10 的堿基占該 reads 總堿例大于 20%的 reads 為低質(zhì)量的 reads)。
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本文編號：2843998