脆性 X 染色體綜合征(Fragile X mental retardation Syndrome,FXS)是一種最常見的遺傳性精神發(fā)育遲滯疾病。FXS在男性中發(fā)病率為1/4000,女性中發(fā)病率為1/6000。其主要癥狀表現為認知和行為缺陷、智力低下、語言學習和交流障礙,長臉、大耳、睪丸巨大。部分病人表現出自閉癥(autism)的癥狀。FXS的發(fā)病原因是位于位于X染色體上Xq27位點的基因Fmrl(Fragile X mental retardation gene 1)的5'端非編碼區(qū)出現多于200 bp CGG三核苷酸重復性突變,相鄰的CpG島高甲基化,導致Fmrl基因表達關閉和編碼蛋白FMRP缺失。FXS的病理改變主要是大腦皮層神經元的樹突棘密度增加,形態(tài)更為細長和彎曲,缺少成熟的蘑菇樣樹突棘。由FXS導致的智力障礙給病人帶來巨大的痛苦,患者從出生到生命結束這一漫長的病程給家庭和社會帶來極其沉重的負擔。目前僅有少數幾種藥物可用于改善部分癥狀。雖然有多種小分子化合物進入臨床試驗,但結果并不理想,其核心癥狀依然無藥可治。大量研究表明在FXS病人外周組織和Fmrl KO小鼠神經元中多種激酶所介導的細胞磷酸化信號轉導功能紊亂。FMRP蛋白的缺失引起神經元多種激酶信號通路異常,而且多表現在磷酸化水平的增加。此外,FMRP可能參與DNA損傷修復,有報導Fmrl敲除促進精母細胞的凋亡。FMRP是一個mRNA結合蛋白,主要起翻譯抑制作用(調控新蛋白合成)。在基因組和轉錄組的水平利用Fmrl KO小鼠對FMRP結合哪些mRNA,調控哪些mRNA的翻譯,維持哪些mRNA的穩(wěn)定性有過—系列的研究。發(fā)現FMRP主要結合在接近900個靶點蛋白mRNA的編碼區(qū)。這些蛋白質包括突觸前、后蛋白和與自閉癥候群相關的蛋白,提示FXS發(fā)病與調控突觸蛋白翻譯緊密相關。研究蛋白質的翻譯(即蛋白質合成)可能為揭示FXS病理機制提供幫助。液相色譜-高分辨質譜聯用為基礎的蛋白組學技術將復雜的組織、細胞蛋白提取物利用胰酶降解為多肽復合物,再用液相色譜-質譜聯用/二級質譜分析的方法得到多肽的二級譜圖,結合完備的蛋白質序列數據庫解析多肽序列,進而大規(guī)模地鑒定特異蛋白質。本實驗收集了 Fmrl野生型和敲除小鼠大腦皮層,利用基于超濾輔助的樣品制備方法,結合串聯質量標簽標記方法和高pH的反向色譜分離,結合高壓液相色譜質譜連用分析獲得大規(guī)模的定量蛋白質組數據。同時再利用二氧化鈦納米顆粒富集磷酸化多肽并用Motif X數據庫預測了磷酸化位點的特征。利用磷酸化特異性抗體和靶向質譜的手段對結果進行驗證,構建模擬磷酸化和模擬磷酸化缺失的突變體導入Hela細胞和神經細胞系中,用激光共聚焦顯微鏡觀察其定位情況。再引入誘導凋亡的脅迫處理,分析應激條件下磷酸化的作用。FMRP通過結合靶蛋白mRNA進而調控蛋白質的合成。本實驗利用甲硫氨酸類似物疊氮同型丙氨酸(AHA)標記新合成蛋白質,用基于疊氮-炔反應的化學生物學方法直接富集新蛋白質,再用質譜檢測并定量新合成的蛋白質。本實驗結果表明小鼠大腦皮層中,共鑒定了 4927個蛋白,上調蛋白56個,下調蛋白36個。這些差異表達蛋白主要富集突觸上,主要與RNA結合、細胞器組裝及細胞壓力調節(jié)等通路相關。磷酸化水平上,共鑒定磷酸化位點7696個,其中上調139個,下調2個,這些差異磷酸化位點主要富集在細胞骨架蛋白結合、actin結合等通路上。通過Motif-X分析歸納出...SP...,..TP...,..RxxS..等基序。我們優(yōu)化了靶向質譜的方法,驗證了其準確度和重復性,在此基礎上驗證了蛋白質組部分蛋白上調的結果。PRKRA模擬磷酸化和模擬磷酸化缺失突變體在基態(tài)下不影響其定位,并且與FMRP有共定位。壓力脅迫下,PRKRA模擬磷酸化突變體促進細胞凋亡,PRKRA模擬磷酸化缺失突變體減少細胞凋亡。甲硫氨酸類似物疊氮同型丙氨酸(AHA)可以用于標記新合成蛋白質,鑒定到新合成蛋白。這些新合成有差異的蛋白可能是FMRP的潛在靶蛋白。綜上,本研究大規(guī)模定量分析了 Fmrl敲除小鼠大腦皮層蛋白質組和磷酸化組的變化,并驗證了其中部分結果。構建了模擬磷酸化和磷酸化缺失的突變體,發(fā)現PRKRAS18磷酸化促進細胞凋亡,PRKRAS18A減少細胞凋亡。針對FMRP調控蛋白質合成的特點,開發(fā)了非天然氨基酸參入,靶向富集新合成蛋白的方案,成功富集到新合成蛋白。這些成果擴大了對FXS疾病的認知程度,為FXS疾病提供了潛在的分子靶標,并為其治療提供了一定的依據。
【學位單位】：華東師范大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R596.1
【部分圖文】：

圖 1-1 FMR1 基因第一號外顯子的 CGG 重復序列數目與疾病相關性[8]正常人有 6 到 50 個 CGG 重復，并且是非甲基化的。脆性 X 攜帶者有 50 到 200 個 CGG 重復序列，并且是非甲基化的，FMRP 蛋白有表達。脆性 X 染色體綜合征患者有大于 200 個 CGG 重復序列，并且是甲基化的，FMRP 蛋白表達降低。1.2 FMRP 蛋白1.2.1 FMRP 蛋白結構FMRP 蛋白包含 N 端結構域、KH1、KH2 結構域和 C 端結構域。其中 N 端結構域上包含核定位信號 NLS。KH 結構域負責結合 RNA，其中 KH2 結構域上第

圖 1-2 FMRP 蛋白結構 [8]FMRP 是一個 RNA 結合蛋白，純化的的 FMRP 具有結合 RNA 的能力[9]。核糖體與蛋白形成 FMRP-mRNP 復合體。有假說認為，當 FMRP 缺失的時候，正處于 FMRP-mRNP 復合體中的 mRNA 翻譯會受到影響，繼而導致認知缺陷[10]。為了鑒定與內源性的 FMRP 有相互作用的 mRNA，首先開發(fā)了一款特異的針對FMRP 蛋白的抗體，流程是用鼠的 FMRP 蛋白免疫 FMRP 敲除的小鼠。得到的抗體分別用于免疫沉 WT 和 KO 的小鼠腦裂解液，IP 下來的 mRNA 經過反轉錄成cDNA，再用芯片雜交。 該芯片包含了 UniGene 數據庫的 19,201 個 mRNA，并用 RT-PCR 驗證了芯片的結果。此后，又開發(fā)了基于光交聯的方法[11]。FMRP亞型 1 和亞型 7 結合了大約 80,000 個位點，其中超過 85%的位點能夠覆蓋到約6,000 個 mRNA。FXR1P 和 FXR2P 蛋白的結合位點與 FMRP 的結合位點相比較，

華東師范大學博士學位論文1.5 蛋白質組學蛋白質組學的最初目標是鑒定蛋白質。其中應用最廣泛的方法是“自底向上”的策略�；玖鞒淌怯妹笇⒌鞍讟悠贩纸獬啥嚯幕旌衔�。多肽經過分離后，在離子源發(fā)生電離帶上電荷，進入質譜后，質譜儀記錄質量電荷比和時間。采集后的數據經過數據處理，得到結果[35]。
【共引文獻】

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本文編號：2837580