目的:類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種常見的全身性自身免疫疾病,但其發(fā)病原因不明。其特征主要是慢性、對稱性、進行性的多關(guān)節(jié)炎。由RA的慢性炎癥導(dǎo)致的骨量丟失是最嚴重的的并發(fā)癥之一。有研究表明,在新診斷的RA患者中,高達25%的患者在治療前就已經(jīng)發(fā)生了骨量流失,有11%的患者已發(fā)展為骨質(zhì)疏松癥。還有研究表明,骨量丟失與細胞因子具有密切的相關(guān)性。細胞因子調(diào)節(jié)著破骨細胞、成骨細胞和免疫系統(tǒng)細胞之間的相互作用,最終維持著骨代謝的平衡。白細胞介素(Interleukin,IL)-35是IL-12家族的新成員,由Epstein-Barr病毒誘導(dǎo)基因3(Epstein-Barr virus-inducible gene 3,Ebi3)亞基和p35(IL-12α)亞基組成。2007年,Vignali的研究組發(fā)現(xiàn)IL-35由調(diào)節(jié)性T細胞(regular T cells,Tregs)分泌并能抑制效應(yīng)性T細胞的功能。我們課題組在之前研究中還發(fā)現(xiàn),在小鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎的成纖維樣滑膜細胞中,IL-35可上調(diào)骨保護素(osteoprotegerin,OPG),并下調(diào)核因子κB受體激活劑配體(receptor activator of nuclear factorκB ligand,RANKL)的表達,表明其在RA中具有潛在的骨保護作用。然而IL-35對RA骨量丟失的具體機制尚未明確,且研究甚少。為了更好的研究IL-35在RA骨量丟失中的作用,本研究將分析IL-35與RA患者骨量丟失相關(guān)指標的相關(guān)性,并進一步探討IL-35對成骨細胞生物學功能的影響以及相關(guān)機制,為IL-35可能成為RA合并骨量丟失新的治療靶點提供理論實驗依據(jù)。研究方法:在第一部分的研究中,選取76名患有RA的絕經(jīng)后婦女作為病例組和53名健康的絕經(jīng)后婦女作為健康對照組。通過酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測血清IL-35水平。使用雙能X射線吸收測定法測量腰椎(L1-L4)和全髖骨的骨礦物質(zhì)密度。通過免疫比濁法測定骨轉(zhuǎn)換標志物,包括堿性磷酸酶(alkaline phosphates,ALP),I型膠原羧基β端肽特殊序列(cross-linked C-terminal telopeptid of type I Collagen I,β-CTX)和25-(OH)VitD_3。在第二部分研究中,選取小鼠前成骨細胞MC3T3E1細胞系為研究對象。擬用TNF-α刺激誘導(dǎo)MC3T3E1細胞系模擬成骨細胞在RA中的炎性環(huán)境。用CCK-8和流式細胞術(shù)檢測IL-35對MC3T3E1細胞系增殖和凋亡的影響。用pNPP偶氮法檢測ALP的活性。用RT-PCR和Western-blot檢測MC3T3E1細胞中OPG和RANKL的表達水平。用茜素紅染色檢測MC3T3E1細胞系體外的礦化能力。在第三部分研究中,加入外源性Dkk-1阻斷Wnt/β-catenin通路,探討IL-35影響成骨細胞生物學功能的可能性機制。結(jié)果:在第一部分研究中:1.絕經(jīng)后RA女性的血清IL-35水平高于健康對照組(P0.0001)。2.與骨質(zhì)減少和骨質(zhì)疏松癥患者相比,骨量正常的患者血清IL-35水平顯著升高(分別為P0.0001,P0.0001)。3.血清IL-35水平與腰椎(L1-L4)骨密度(r=0.64,P0.0001)和全髖關(guān)節(jié)骨密度為(r=0.43,P=0.0001)呈正相關(guān)。4.血清IL-35水平與β-CTX呈負相關(guān)(r=-0.35,P=0.0017)。血清IL-35水平與ALP無關(guān)(r=0.2,P=0.077)。但ALP組增加組的血清IL-35水平高于正常ALP組(P=0.0006)。5.血清IL-35水平與25(OH)VitD_3呈正相關(guān)(r=0.37,P=0.0011)。6.在多因素線性回歸模型中,IL-35在腰椎(L1-L4)和全髖的BMD中保持顯著相關(guān)性(OR=0.463,P=0.026;OR=0.254,P=0.025)。在第二部分研究中:1.CCK-8結(jié)果顯示,經(jīng)過IL-35處理的第1天、第3天、第5天和第7天,與空白對照組比較(IL-35為0ng/mL),IL-35促進MC3T3E1細胞的增殖(P0.05)。在經(jīng)過TNF-α誘導(dǎo)的MC3T3E1細胞中,IL-35也促進MC3T3E1細胞的增殖(P0.05),說明IL-35對MC3T3E1和TNF-α誘導(dǎo)的MC3T3E1細胞系的增殖具有促進作用。2.流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,經(jīng)過不同濃度的IL-35(25、50、100ng/mL)處理后,與空白對照組比較(IL-35為0ng/mL),MC3T3E1細胞的凋亡降低(P0.05),說明IL-35對MC3T3E1細胞系和TNF-α誘導(dǎo)的MC3T3E1細胞系的凋亡具有抑制作用。3.pNPP偶氮法結(jié)果顯示,在MC3T3E1細胞系和經(jīng)過TNF-α誘導(dǎo)的MC3T3E1細胞中,經(jīng)過第3天、第5天、第7天和第9天,經(jīng)過IL-35(50ng/mL)處理后,與空白對照組比較(IL-35為0ng/mL),MC3T3E1細胞的ALP活性顯著增強(P0.05),說明IL-35促進MC3T3E1細胞系和TNF-α誘導(dǎo)的MC3T3E1細胞系的ALP的活性。4.RT-PCR和Western-blot結(jié)果顯示,MC3T3E1和經(jīng)過TNF-α誘導(dǎo)的MC3T3E1細胞中,與空白組(IL-35為0ng/mL)比較,IL-35顯著升高OPG的表達(P0.05),顯著降低RANKL的表達(P0.05)。另外,我們的研究還發(fā)現(xiàn),經(jīng)過TNF-α誘導(dǎo)的MC3T3E1細胞的OPG、RANKL的表達比未經(jīng)TNF-α處理的MC3T3E1細胞的OPG、RANKL的表達也是顯著升高的(P0.05)。5.茜素紅染色結(jié)果顯示,在MC3T3E1和經(jīng)過TNF-α誘導(dǎo)的MC3T3E1細胞中,經(jīng)過礦化液誘導(dǎo)的第20天,與空白對照組比較(IL-35為0ng/mL),MC3T3E1細胞的體外礦化能力顯著增強(P0.05),說明IL-35對MC3T3E1細胞系的體外礦化能力具有促進作用。在第三部分研究中:1.加入外源性Dkk-1后,IL-35誘導(dǎo)的MC3T3E1細胞增殖顯著下降(P0.05)。2.IL-35誘導(dǎo)的MC3T3E1的細胞凋亡顯著升高(P0.05)。3.IL-35誘導(dǎo)的ALP活性顯著下降(P0.05)。4.體外礦化能力也顯著下降(P0.05)。5.MC3T3E1細胞表達的OPG和RANKL也顯著下調(diào)(P0.05)。結(jié)論:在第一部分研究中:血清IL-35水平與絕經(jīng)后RA患者的BMD,骨代謝指標和維生素D水平相關(guān),提示IL-35在RA骨丟失的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。在第二部分研究中:1.IL-35促進MC3T3E1細胞系和TNF-α誘導(dǎo)的MC3T3E1細胞系的增殖。2.IL-35抑制MC3T3E1細胞系和TNF-α誘導(dǎo)的MC3T3E1細胞系的凋亡。3.IL-35增加MC3T3E1細胞系和TNF-α誘導(dǎo)的MC3T3E1細胞系的ALP活性。4.IL-35增加MC3T3E1細胞系和TNF-α誘導(dǎo)的MC3T3E1細胞系OPG mRNA和蛋白的表達,降低RANKL mRNA和蛋白的表達。5.IL-35促進MC3T3E1細胞系和TNF-α誘導(dǎo)的MC3T3E1細胞系體外礦化的能力。在第三部分研究中:1.IL-35通過Wnt/β-catenin途徑促進TNF-α誘導(dǎo)的MC3T3E1細胞系的增殖。2.IL-35通過Wnt/β-catenin途徑抑制TNF-α誘導(dǎo)的MC3T3E1細胞系的凋亡。3.IL-35通過Wnt/β-catenin途徑促進TNF-α誘導(dǎo)的MC3T3E1細胞系的ALP活性。4.IL-35通過Wnt/β-catenin途徑促進TNF-α誘導(dǎo)的MC3T3E1細胞系外礦化能力。5.IL-35通過Wnt/β-catenin途徑上調(diào)TNF-α誘導(dǎo)的MC3T3E1細胞系的OPG表達,同時下調(diào)RANKL的表達。
【學位單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R593.22
【部分圖文】：

35 在絕經(jīng)期 RA 患者和健康對照組中的比較。結(jié)果顯示，RA 患者 IL-35 顯著高于健康對照組（P<0.0001）�；颊� IL-35 的血清水平與 BMD 的相關(guān)性分析據(jù) WHO 骨質(zhì)疏松診斷標準將 RA 患者分為 3 組：分別為 BM、骨量減少組（n=44）和骨質(zhì)疏松組（n=15），比較三組中 IL顯示，與骨量減少組（5.9（4.3-6.4）pg/mL）和骨質(zhì)疏松組（4.比，骨量正常組的 RA 患者血清 IL-35 水平顯著升高(11.8（6.7-3 P<0.0001，P<0.0001）。但骨量減少組和骨質(zhì)疏松組中的 IL-3差異（P=0.1667）（圖 3.2.1）。單因素相關(guān)分析結(jié)果顯示，血（L1-L4）BMD 呈正相關(guān)（r=0.64，P<0.0001）（圖 3.2.2），同D 呈正相關(guān)（r=0.43，P=0.0001）（圖 3.2.3）。

5 在不同組間的血清水平比較。根據(jù) WHO 骨質(zhì)疏松診斷標準將 RA 患者 正常組（n=17）、骨量減少組（n=44）和骨質(zhì)疏松組（n=15），比較三。結(jié)果顯示，與骨量減少組和骨質(zhì)疏松組相比，骨量正常組的 RA 患者高（分別為 P<0.0001，P<0.0001）。骨量減少組和骨質(zhì)疏松組中的 IL-3無統(tǒng)計學差異（P=0.1667）。

-35 在不同組間的血清水平比較。根據(jù) WHO 骨質(zhì)疏松診斷標準將 RA 患者D 正常組（n=17）、骨量減少組（n=44）和骨質(zhì)疏松組（n=15），比較三平。結(jié)果顯示，與骨量減少組和骨質(zhì)疏松組相比，骨量正常組的 RA 患者升高（分別為 P<0.0001，P<0.0001）。骨量減少組和骨質(zhì)疏松組中的 IL-3無統(tǒng)計學差異（P=0.1667）。

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