【摘要】：目的:觀察耐受性樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells,DC)在輸入膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen induced arthritis,CIA)大鼠體內(nèi)后能否形成微嵌合狀態(tài),探討耐受性DC對(duì)CIA大鼠治療干預(yù)的內(nèi)在機(jī)制。方法:以CIA雌性SD大鼠和正常雄性SD大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。1.核因子-κB(Nuclearfactor-kappa B,NF-κB)寡核苷酸誘騙策略(oligodeoxynucleotidedecoy,ODNDecoy)誘導(dǎo) CIA 雌性 SD 大鼠和正常雄性SD大鼠來(lái)源耐受性DC的構(gòu)建:(1)正常雌性SD大鼠左足跖部皮內(nèi)注射200μl牛二型膠原(BIIC)乳劑進(jìn)行CIA模型制備;(2)取CIA雌性SD大鼠(初次免疫后第13天)和正常雄性SD大鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞,用粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和白細(xì)胞介素-4(IL-4)培養(yǎng)為DC,經(jīng)NF-κB ODN Decoy誘導(dǎo)為耐受性DC:(3)CIA雌性SD大鼠和正常雄性SD大鼠來(lái)源的培養(yǎng)細(xì)胞各分為4組;(4)DC生物學(xué)性狀觀察:倒置顯微鏡、吉姆薩染色觀察細(xì)胞形態(tài)特征,臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞率,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大鼠DC特異性標(biāo)志OX-62鑒定純度,檢測(cè)DC表面CD80、CD86分子表達(dá)情況和同種異體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)評(píng)估耐受性DC的耐受性及其穩(wěn)定程度。2.CIA大鼠體內(nèi)輸入耐受性DC微嵌合狀態(tài)的觀察:(1)制備CIA雌性SD大鼠和正常雄性SD大鼠來(lái)源的耐受性DC,并負(fù)載BIIC,記為BIIC-Decoy DC,用DiR熒光染料標(biāo)記,記為BIIC-DecoyDC(?);(2)臺(tái)盼藍(lán)染色評(píng)估細(xì)胞標(biāo)記DiR熒光染料前后活細(xì)胞率,MTT實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)BIIC-Decoy DC(?)對(duì)細(xì)胞活性的影響;(3)活體成像系統(tǒng)(In Vivo Imaging System,IVIS)觀察BIIC-Decoy DC(?)熒光強(qiáng)度;(4)IVIS活體成像實(shí)驗(yàn)分組:A組:同種異體正常雄性SD大鼠來(lái)源BIIC-Decoy DC(?),于病程第5天,尾靜脈輸入CIA大鼠(即病程早期CIA)體內(nèi);B組:同種異體正常雄性SD大鼠來(lái)源BIIC-Decoy DC(?),于病程第20天,尾靜脈輸入CIA大鼠(即病程中期CIA)體內(nèi);C組:CIA大鼠自體來(lái)源BIIC-Decoy DC(?)尾靜脈輸入病程中期CIA大鼠體內(nèi)。正常雌鼠對(duì)照(normal female control,NFc)組:同種異體正常雄性SD大鼠來(lái)源BIIC-Decoy DC(?)尾靜脈輸入正常雌性SD大鼠體內(nèi);正常雄鼠對(duì)照(normal male control,NMc)組:正常雄性SD大鼠自體來(lái)源BIIC-Decoy DC(?)尾靜脈輸入正常雄性SD大鼠體內(nèi)。非標(biāo)記細(xì)胞對(duì)照(cell control):用無(wú)熒光標(biāo)記的BIIC-Decoy DC代替標(biāo)記細(xì)胞,作為A、B、C組的非標(biāo)記細(xì)胞對(duì)照,記為Acc、Bcc、Ccc組。模型空白對(duì)照(model control):用磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline,PBS)代替標(biāo)記細(xì)胞,作為A、B、C組的模型空白對(duì)照,記為Amc、Bmc、Cmc組。(5)IVIS活體成像:將上述兩種來(lái)源BIIC-Decoy DC(?)經(jīng)尾靜脈輸入各組大鼠體內(nèi)后4h、24h、5day、10day、20day、25day等時(shí)間點(diǎn),動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞進(jìn)入大鼠體內(nèi)后的遷移、分布及微嵌合狀態(tài);(6)活體成像結(jié)束后檢測(cè)指標(biāo):取離體臟器進(jìn)行IVIS成像;取血清檢測(cè)IL-2和IFN-y;IL-4和IL-10等細(xì)胞因子水平;取踝關(guān)節(jié)作病理切片。結(jié)果:(1)耐受性DC的構(gòu)建:CIA雌性SD大鼠和正常雄性SD大鼠來(lái)源脾臟單個(gè)核細(xì)胞成功誘導(dǎo)為耐受性DC,其活細(xì)胞率均94%,細(xì)胞純度均85%;DC表面CD80、CD86分子表達(dá)情況和同種異體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)結(jié)果顯示其耐受性具有較好的穩(wěn)定程度;(2)CIA雌性SD大鼠和正常雄性SD大鼠來(lái)源的耐受性DC負(fù)載BIIC,成功構(gòu)建BIIC-Decoy DC,標(biāo)記DiR熒光染料,記為BIIC-Decoy DC(?);(3)臺(tái)盼藍(lán)染色:DiR熒光染料標(biāo)記前后BIIC-Decoy DC活細(xì)胞率均在95%左右;(4)MTT實(shí)驗(yàn):結(jié)果顯示DiR熒光染料標(biāo)記上述兩種來(lái)源BIIC-Decoy DC后,對(duì)其細(xì)胞活性無(wú)影響;(5)IVIS成像檢測(cè)結(jié)果顯示DiR熒光染料成功標(biāo)記上BIIC-Decoy DC,且熒光強(qiáng)度隨細(xì)胞數(shù)量增加而增強(qiáng);(6)IVIS活體成像結(jié)果:熒光信號(hào)主要集中在胸腹部,隨成像時(shí)間延長(zhǎng)可向其他部位遷移,如四肢關(guān)節(jié);熒光強(qiáng)度隨成像時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低;熒光信號(hào)多以24h達(dá)高峰,最長(zhǎng)觀察至第35天,仍可見(jiàn)熒光信號(hào);(7)離體器官I(mǎi)VIS成像結(jié)果:熒光信號(hào)主要集中在肺臟、脾臟和淋巴結(jié)中,以肺臟熒光信號(hào)最強(qiáng),肝臟、心臟和腎臟熒光信號(hào)相對(duì)較弱;(8)血清細(xì)胞因子水平檢測(cè):在病程早期和病程中期CIA大鼠模型組中,IFN-γ、IL-2等Th1型細(xì)胞因子表達(dá)水平較高,IL-10、IL-4等Th2型細(xì)胞因子較低;而在病程早期和病程中期CIA大鼠治療組中,IFN-γ、IL-2等Th1型細(xì)胞因子表達(dá)明顯降低,IL-10、IL-4等Th2型細(xì)胞因子表達(dá)明顯升高;(9)踝關(guān)節(jié)病理結(jié)果:CIA雌性SD大鼠和正常雄性SD大鼠來(lái)源BIIC-Decoy DC對(duì)病程早期CIA和病程中期CIA大鼠均顯示出良好的治療效果。結(jié)論:(1)改良DC提取方法,獲得CIA雌性SD大鼠和正常雄性SD大鼠來(lái)源耐受性DC純度均85%;(2)CIA雌性SD大鼠和正常雄性SD大鼠來(lái)源BIIC-Decoy DC對(duì)病程早期CIA和病程中期CIA大鼠均具有較好的治療效果;(3)利用IVIS成像系統(tǒng)動(dòng)態(tài)觀察DiR熒光染料標(biāo)記CIA雌性SD大鼠和正常雄性SD大鼠來(lái)源BIIC-Decoy DC經(jīng)尾靜脈輸入CIA大鼠體內(nèi)后,廣泛分布于肺臟、脾臟、淋巴結(jié)等組織,持續(xù)至第35天仍可檢測(cè)到熒光信號(hào),初步判斷微嵌合狀態(tài)形成。血清細(xì)胞因子水平檢測(cè)結(jié)果顯示微嵌合狀態(tài)形成的同時(shí),體內(nèi)細(xì)胞因子格局由Th1向Th2方向偏移,有利于免疫耐受的形成。
【學(xué)位授予單位】：貴州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R593.22
【圖文】：

８天）（集落）；Ｅ表示ＣＩＡ雌性大鼠來(lái)源ｃｏｎｔｒｏｌ邋（第８天）（樹(shù)突狀突起）；Ｆ表示Ｃ１Ａ大逡逑鼠來(lái)源邋ＢＩＩＣ－Ｄｅｃｏｙ邋ＤＣ。逡逑圖２－丨（’丨Ａ雌性大鼠來(lái)源丨）（’倒置顯微鏡結(jié)果（２０0ｘ）逡逑Ｆｉｇ．２－１邋Ｔｈｅ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋ＤＣ邋ｆｒｏｍ邋ＣＩＡ邋ｆｅｍａｌｅ邋ｒａｔｓ（２０（）ｘ）逡逑ｃ？邋ｍｉ逡逑Ａ邐Ｒ邋—逡逑注：Ａ表示Ｃｏｎｔｒｏｌ組ＤＣ；邋Ｂ表示Ｄｅｃｏｙ組ＤＣ。逡逑圖２－２邋ＣＩＡ雌性大鼠ＤＣ吉姆薩染色結(jié)果（１０（）ｘ）逡逑Ｆｉｇ．２－２邋Ｔｈｅ邋Ｇｉｅｍｓａ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋ＤＣ邋ｄｅｒｉｖｅｄ邋ｆｒｏｍ邋ＣＩＡ邋ｆｅｍａｌｅ邋ｒａｔｓ邋（邋１邋（）0ｘ邋）逡逑２．２邋ＣＩＡ雌性ＳＤ大鼠和正常雄性ＳＤ大鼠來(lái)源ＤＣ細(xì)胞活性檢測(cè)逡逑２．２．１臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)活細(xì)胞率逡逑圖八，Ｂ為剛提取出的單個(gè)核細(xì)胞，圖Ｃ，Ｄ為培養(yǎng)至第８天的ＤＣ，重復(fù)實(shí)驗(yàn)逡逑臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果顯示活細(xì)胞率均在９４％左右（見(jiàn)圖２－３Ａ－Ｄ）。圖Ｅ，Ｆ為ＤｉＲ熒逡逑光染料標(biāo)記前，Ｇ，Ｈ為ＤｉＲ熒光染料標(biāo)記后，標(biāo)記前后臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果顯示活逡逑細(xì)胞率均在９５％左右（見(jiàn)圖Ｅ－Ｈ）。逡逑本文受?chē)?guó)家白然科學(xué)？金地區(qū)科學(xué)

８天）（集落）；Ｅ表示ＣＩＡ雌性大鼠來(lái)源ｃｏｎｔｒｏｌ邋（第８天）（樹(shù)突狀突起）；Ｆ表示Ｃ１Ａ大逡逑鼠來(lái)源邋ＢＩＩＣ－Ｄｅｃｏｙ邋ＤＣ。逡逑圖２－丨（’丨Ａ雌性大鼠來(lái)源丨）（’倒置顯微鏡結(jié)果（２０0ｘ）逡逑Ｆｉｇ．２－１邋Ｔｈｅ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋ＤＣ邋ｆｒｏｍ邋ＣＩＡ邋ｆｅｍａｌｅ邋ｒａｔｓ（２０（）ｘ）逡逑ｃ？邋ｍｉ逡逑Ａ邐Ｒ邋—逡逑注：Ａ表示Ｃｏｎｔｒｏｌ組ＤＣ；邋Ｂ表示Ｄｅｃｏｙ組ＤＣ。逡逑圖２－２邋ＣＩＡ雌性大鼠ＤＣ吉姆薩染色結(jié)果（１０（）ｘ）逡逑Ｆｉｇ．２－２邋Ｔｈｅ邋Ｇｉｅｍｓａ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋ＤＣ邋ｄｅｒｉｖｅｄ邋ｆｒｏｍ邋ＣＩＡ邋ｆｅｍａｌｅ邋ｒａｔｓ邋（邋１邋（）0ｘ邋）逡逑２．２邋ＣＩＡ雌性ＳＤ大鼠和正常雄性ＳＤ大鼠來(lái)源ＤＣ細(xì)胞活性檢測(cè)逡逑２．２．１臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)活細(xì)胞率逡逑圖八，Ｂ為剛提取出的單個(gè)核細(xì)胞，圖Ｃ，Ｄ為培養(yǎng)至第８天的ＤＣ，重復(fù)實(shí)驗(yàn)逡逑臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果顯示活細(xì)胞率均在９４％左右（見(jiàn)圖２－３Ａ－Ｄ）。圖Ｅ，Ｆ為ＤｉＲ熒逡逑光染料標(biāo)記前，Ｇ，Ｈ為ＤｉＲ熒光染料標(biāo)記后，標(biāo)記前后臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果顯示活逡逑細(xì)胞率均在９５％左右（見(jiàn)圖Ｅ－Ｈ）。逡逑本文受?chē)?guó)家白然科學(xué)？金地區(qū)科學(xué)

核細(xì)胞；Ｃ，Ｄ表示培養(yǎng)第８天ＤＣ；邋Ｅ，Ｆ為ＤｉＲ熒光染料標(biāo)記前；Ｇ，Ｈ為ＤｉＲ熒光染料標(biāo)記逡逑后。逡逑圖２－３邋ＤＣ臺(tái)盼藍(lán)染色觀察（２０0ｘ）逡逑Ｆｉｇ．２－３邋Ｉ＇ｈｃ邋ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＤＣ邋ｔｒｙｐａｎ邋ｂｌｕｅ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋（２０0ｘ）逡逑２．２．２邋ＭＴＴ檢測(cè)ＤｉＲ焚光染料標(biāo)記ＣＩＡ雌性大鼠和正常雄性大鼠來(lái)源ＢＩＩＣ－Ｄｅｃｏｙ逡逑ＤＣ后細(xì)胞活性結(jié)果逡逑（１）邋ＤｉＫ熒光染料標(biāo)記ＣＩＡ雌性大鼠來(lái)源的ＢｌＩＣ－Ｄｅｃｏｙ邋ＤＣ活性檢測(cè)結(jié)果逡逑①

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 宋歌;呂月濤;狄林林;宗文納;陳伯旺;;早期腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)對(duì)重癥肺炎大鼠免疫功能的影響分析[J];中國(guó)醫(yī)學(xué)前沿雜志(電子版);2017年01期

2 葉敏;陳達(dá)柔;陳宇中;杜少冰;杜展鑫;李玉鳳;唐s鉈

本文編號(hào)：2785351