【摘要】：目的:我們發(fā)現(xiàn)無(wú)機(jī)砷可抑制過(guò)氧化物酶體增殖劑激活受體γ(PPARγ),激活細(xì)胞自噬過(guò)程,同時(shí)�；撬峥娠@著激活PPARγ并抑制自噬過(guò)程,但牛磺酸緩解胰島素抵抗的作用機(jī)制和靶標(biāo)尚不清楚。因此,本研究擬探索牛磺酸對(duì)砷所致胰島素抵抗進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)干預(yù)的可行性及可能機(jī)制。方法:體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,以C57BL/6J雄性小鼠為研究對(duì)象,通過(guò)自由飲水的方式暴露于濃度為1~4 mg/L的三氧化二砷(As2O3),牛磺酸保護(hù)組在自由飲用濃度為4 mg/L的As2O3基礎(chǔ)之上,每天用250 mg/kg�；撬峁辔�,為期12周。12周后,行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)檢測(cè)小鼠葡萄糖耐受能力;測(cè)量小鼠肝臟重量;制作肝臟石蠟切片,用糖原染色法(PAS染色)檢測(cè)肝組織中糖原合成情況,用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)肝組織中磷酸化蛋白激酶C(p-Akt)蛋白的表達(dá);用實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)肝組織中糖異生基因葡萄糖-6-磷酸酶(Glucose-6-phosphatase,G6pase)、果糖-1,6-二磷酸酶(Fructose-1,6-bisphosphatase,FBPase)、叉頭框蛋白(Forkhead box protein O1,FOXO1)、磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶(Phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)和過(guò)氧化物酶體增殖活化受體γ共激活因子-1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha,PGC-1α)以及糖酵解基因L-型丙酮酸激酶(L-pyruvate kinase,L-PK)和葡萄糖激酶(Glucokinase,GK)的表達(dá);用免疫蛋白印記法(Western blot)檢測(cè)糖原合成酶激酶3β(GSK3β)、磷酸化GSK3β(p-GSK3β)、糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(GLUT2)以及通路相關(guān)蛋白Akt、p-Akt、PPARγ的表達(dá)情況。體外實(shí)驗(yàn)中,以人HepG2細(xì)胞為研究對(duì)象。用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT)檢測(cè)不同濃度亞砷酸鈉(Na As O_2)處理后的HepG2細(xì)胞存活率的變化;1~4μM Na As O_2作用HepG2細(xì)胞24 h,用Western blot檢測(cè)HepG2細(xì)胞中通路相關(guān)蛋白PPARγ、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體2(mTORC2)、Akt、p-Akt、微管相關(guān)蛋白輕鏈3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)、P62/SQSTM1蛋白的表達(dá)水平;預(yù)先使用PPARγ激活劑羅格列酮(RGS)、mTORC2激活劑棕櫚酸鹽(PA)、自噬小體形成抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)和牛磺酸處理后,用4μM濃度的Na As O_2作用HepG2細(xì)胞24 h。用Western blot檢測(cè)HepG2細(xì)胞中通路相關(guān)蛋白PPARγ、mTORC2、Akt、p-Akt、LC3-Ⅱ、P62以及糖代謝相關(guān)蛋白GSK3β、p-GSK3β、GLUT2的表達(dá)情況;用葡萄糖氧化酶-過(guò)氧化物酶法檢測(cè)HepG2細(xì)胞中葡萄糖攝取量。結(jié)果:暴露于濃度為1~4 mg/L的As2O3后,小鼠肝臟重量顯著減輕,而�；撬岜Ｗo(hù)組小鼠肝臟重量與高濃度染毒組(單純暴露于As2O3,濃度為4 mg/L)相比顯著增高;OGTT結(jié)果顯示,在0、15、30、120 min時(shí),高濃度染毒組小鼠血糖明顯高于對(duì)照組且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,牛磺酸干預(yù)后血糖水平下降且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。葡萄糖口服耐量測(cè)試血糖曲線(xiàn)下面積(OGTT-AUC)結(jié)果顯示As2O3暴露可引起葡萄糖耐量異常,牛磺酸干預(yù)后可緩解As2O3引起的葡萄糖耐量異常;PAS染色結(jié)果顯示,肝組織糖原含量隨著As2O3染毒濃度的增加而顯著減少,而�；撬岜Ｗo(hù)組中肝組織糖原含量與高濃度染毒組相比顯著增加;RT-PCR結(jié)果顯示肝組織糖異生基因表達(dá)隨As2O3染毒濃度的增加而增加,糖酵解基因表達(dá)隨As2O3染毒濃度的增加而減少。同上,�；撬岜Ｗo(hù)組保護(hù)作用明顯,與高濃度染毒組相比,�；撬岜Ｗo(hù)組中糖異生基因表達(dá)減少而糖酵解基因表達(dá)有所增加;Western blot結(jié)果顯示隨著As2O3染毒濃度的增加,肝組織中PPARγ、p-Akt和GLUT2蛋白表達(dá)顯著減少,p-GSK3β蛋白表達(dá)顯著增加,免疫熒光結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證肝組織p-Akt表達(dá)隨As2O3染毒濃度的增加而減少,與高濃度染毒組相比,牛磺酸保護(hù)組的保護(hù)作用顯著,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在體外實(shí)驗(yàn)中,用不同濃度NaAsO_2作用HepG2細(xì)胞24 h,細(xì)胞存活率隨Na As O_2染毒濃度的增加而降低;1~4μM Na As O_2作用HepG2細(xì)胞24 h,Western blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,PPARγ、mTORC2、p-Akt和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)降低,P62蛋白表達(dá)增加。加入RGS和�；撬犷A(yù)處理后,PPARγ蛋白表達(dá)與染毒組(單純暴露于Na As O_2,濃度為4μM)相比有顯著增加。加入RGS、PA和牛磺酸預(yù)處理后,mTORC2和p-Akt蛋白表達(dá)與染毒組相比有顯著增加。加入RGS、PA、3-MA和牛磺酸預(yù)處理后,LC3-Ⅱ和p-GSK3β蛋白表達(dá)與染毒組相比有顯著降低,P62和GLUT2表達(dá)與之相反;葡萄糖氧化酶-過(guò)氧化物酶測(cè)定結(jié)果顯示,在HepG2細(xì)胞中,與對(duì)照組相比,染毒組培基中的葡萄糖含量增加。加入RGS、PA、3-MA和�；撬岣深A(yù)后,與染毒組相比,培基中的葡萄糖含量有所減少,提示細(xì)胞攝取葡萄糖能力增加。結(jié)論:�；撬嵬ㄟ^(guò)PPARγ-mTORC2通路調(diào)控自噬緩解砷所致胰島素抵抗。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R587.1;R595
【圖文】：

19圖 1As2O3對(duì)小鼠肝臟糖代謝的影響以及�；撬岬谋Ｗo(hù)作用1~4 mg/kg As2O3處理 C57BL/6J 小鼠 12 周，牛磺酸保護(hù)組小鼠在 4 mg/kg As2O3染毒基礎(chǔ)上每天用 250mg/kg �；撬徇M(jìn)行灌胃。（A）小鼠肝臟重量。（B-C）小鼠 OGTT 以及小鼠 OGTT-AUC。n=7，條圖以均值±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示，* 表示與對(duì)照組相比較，P<0.05，** 表示與對(duì)照組相比較，P<0.01，#表示與高濃度染毒組相比較，P<0.05，##表示與高濃度染毒組相比較，P<0.01。（D）PAS 染色測(cè)定小鼠肝臟糖原含量。1.2 As2O3對(duì)小鼠肝臟糖代謝基因水平的影響以及牛磺酸的保護(hù)作用我們對(duì)小鼠肝臟組織中糖酵解基因和糖異生基因進(jìn)行了檢測(cè)。RT-PCR 結(jié)果顯示，與正常組小鼠相比，高濃度染毒組小鼠肝臟糖酵解基因： L-PK 和 GK 的表達(dá)水平顯著降低。給予�；撬犷A(yù)處理后，與高濃度染毒組相比，各基因表達(dá)水平均

20圖 2As2O3對(duì)小鼠肝臟糖代謝基因水平的影響以及牛磺酸的保護(hù)作用 mg/kg As2O3處理C57BL/6J小鼠12周，牛磺酸保護(hù)組小鼠在4 mg/kg As2O3染毒基礎(chǔ)上每天用25進(jìn)行灌胃。（A）RT-PCR 檢測(cè)糖酵解基因 GK 和 L-PK 表達(dá)水平。（B）RT-PCR 檢測(cè)糖異生基因 G6e、FOXO1、PEPCK 和 PGC-1 表達(dá)水平。n=3，條圖以均值±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示，* 表示與對(duì)照組相，** 表示與對(duì)照組相比較，P<0.01，##表示與高濃度染毒組相比較，P<0.01。 As2O3對(duì)小鼠肝臟糖代謝蛋白水平的影響以及�；撬嵊肳estern blot 結(jié)果顯示，GLUT2 蛋白的表達(dá)隨 As2O3染毒劑量的增加而T2 是肝臟進(jìn)行葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的重要載體，其表達(dá)下降提示 As2O3暴露降低萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力。p-GSK3β 隨 As2O3染毒劑量的增加而增加,提示糖原合成

圖 3As2O3對(duì)小鼠肝臟糖代謝蛋白水平的影響以及�；撬岬谋Ｗo(hù)作用1~4 mg/kg As2O3處理 C57BL/6J 小鼠 12 周，�；撬岜Ｗo(hù)組小鼠在 4 mg/kg As2O3染毒基礎(chǔ)上每天用 250mg/kg 牛磺酸進(jìn)行灌胃。（A）Western blot 檢測(cè) GLUT2、GSK3β、p-GSK3β 蛋白表達(dá)，以 β-actin 作為內(nèi)參。（B）GLUT2 蛋白的顯影密度分析，GLUT2 相對(duì)表達(dá)水平以占 β-actin 的百分比來(lái)表示。（C）p-GSK3β 蛋白的顯影密度分析，p-GSK3β 相對(duì)表達(dá)水平以占 GSK3β 的百分比來(lái)表示。n=3，條圖以均值±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示，* 表示與對(duì)照組相比較，P<0.05，** 表示與對(duì)照組相比較，P<0.01，#表示與高濃度染毒組相比較，P<0.05，##表示與高濃度染毒組相比較，P<0.01。1.4 As2O3對(duì)小鼠肝臟 PPARγ 和 p-Akt 蛋白表達(dá)的影響以及�；撬岬谋Ｗo(hù)作用PPARγ 和 mTORC2 對(duì)調(diào)控肝臟糖脂代謝起著重要作用。給予 1~4 mg/kgAs2O3處理后，PPARγ 和 mTORC2 的靶蛋白 p-Akt 蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比均顯著下降。與高濃度染毒組相比，�；撬岜Ｗo(hù)組中 PPARγ 和 p-Akt 蛋白表達(dá)水平均有所增加（如圖 4A-C 所示）。組織免疫熒光進(jìn)一步驗(yàn)證肝組織 p-Akt 的表達(dá)，其結(jié)果與

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本文編號(hào)：2771410