【摘要】：一、研究背景和研究目的鉛是一種廣泛存在于生活環(huán)境和職業(yè)環(huán)境的有毒重金屬,長期暴露于高鉛環(huán)境,將嚴(yán)重?fù)p傷神經(jīng)、造血、消化道和生殖等多個(gè)系統(tǒng),對兒童神經(jīng)系統(tǒng)的影響尤為顯著。目前,對于鉛中毒的治療多采用金屬螯和劑,如依地酸二鈉鈣(CaNa2EDTA)、2,3-二巰基丁二酸(DMSA),研究證明,金屬螯和劑會產(chǎn)生持續(xù)的胃腸道不良反應(yīng)、“過絡(luò)合綜合征”、肝腎毒性等毒副作用,不適用于孕婦、哺乳期婦女及兒童。因此,需要尋找新的方法或制劑防治這類人群的鉛中毒。國內(nèi)外研究證明多種益生菌可吸附體內(nèi)、外的重金屬,但仍少有涉及分離吸附鉛的益生菌的研究。本研究擬從健康新生兒糞便中分離益生性能佳、鉛吸附力強(qiáng)的乳酸菌,并構(gòu)建鉛暴露母鼠致子代鼠鉛中毒模型,探究該乳酸菌對鉛暴露母鼠及鉛中毒子代鼠的保護(hù)作用。二、研究方法1.利用成年無特定病原體(SPF)級C57BL/6小鼠構(gòu)建母鼠孕期及哺乳期暴露鉛致子代鼠鉛中毒模型,母鼠經(jīng)飲用濃度為200mg/L的鉛水,直至子代鼠21日齡時(shí)處死母鼠及子代鼠,稱量子代鼠體重及肝、腎、腦等器官的重量,取血、骨、腦、腎、肝臟及小腸,進(jìn)行鉛濃度檢測;肝臟進(jìn)行GSH、GSH-Px、SOD及NO等氧化應(yīng)激因子檢測;對大腦及小腸作HE染色,評價(jià)其病理損傷情況。選擇鼠李糖乳桿菌GG株(Lactobacillus rhamnosus GG,LGG)對鉛暴露母鼠進(jìn)行干預(yù),探討益生菌LGG對鉛中毒子代鼠發(fā)揮保護(hù)作用。2.收集健康新生兒糞便為來源,利用中央擴(kuò)散法分離并篩選具有鉛吸附力的乳酸菌,并測定分離菌的生理生化特性、益生黏附特性、抑制致病菌特性及體外鉛吸附能力等性能。3.利用1成功構(gòu)建的母鼠鉛暴露致子代鼠鉛中毒模型,降低母鼠飲用鉛水的濃度為1OOmg/L,并使用篩選所得的乳酸菌進(jìn)行干預(yù),稱量母鼠及子代鼠體重及肝、腎、腦等器官的重量,取血、骨、腦、腎、肝臟及小腸,進(jìn)行鉛濃度檢測;對子代鼠肝臟及腎臟中NO等氧化應(yīng)激因子檢測;糞便進(jìn)行16SrRNA測序;并對大腦及小腸作HE染色,評價(jià)其病理損傷情況。探究分離所得的具有鉛吸附力的乳酸菌對鉛暴露母鼠及鉛中毒子代鼠的保護(hù)作用。三、研究結(jié)果1.母鼠經(jīng)飲用200mg/L的醋酸鉛水暴露鉛,導(dǎo)致子代鼠體重和肝腦的臟器指數(shù)降低而腎的臟器指數(shù)升高(P0.05),血、骨、腦和腎組織的鉛含量升高(p0.05),肝臟中GSH、GSH-Px、SOD等活性降低、NO活性升高(p0.05),腦及小腸出現(xiàn)病理損傷,成功建立母鼠鉛暴露致子代鼠鉛中毒模型。2.使用LGG干預(yù)母鼠后可使子代鼠體重和肝腦的臟器指數(shù)升高、腎的臟器指數(shù)降低(p0.05),并減少鉛在子代鼠血液、腦、腎和骨骼等組織的蓄積量(p0.05),肝臟GSH、GSH-Px、SOD等抗氧化應(yīng)激因子活性升高(p0.05),而氧化應(yīng)激因子NO活性降低(p0.05),且子代鼠腦及小腸的病理損傷得到改善。3.從健康新生兒糞便中分離獲得一株干酪乳桿菌,命名為SYF-08,保藏于廣東省微生物菌種保藏中心,編號為GDMCC 60441。該菌生長穩(wěn)定、益生性能良好、可穩(wěn)定地黏附于腸道上皮細(xì)胞,鉛吸附力強(qiáng),在250ppm的鉛溶液中,SYF-08的鉛吸附率高達(dá)到51.00±6.81%,在濃度為2500mg/L的MRS平板上仍能生長。4.降低母鼠飲用的醋酸鉛水濃度為1OOmg/L,仍可致子代鼠鉛中毒。使用SYF-08干預(yù)鉛暴露母鼠后,子代鼠體重和肝腦的臟器指數(shù)升高而腎的臟器指數(shù)降低(p0.05),鉛在母鼠血液、骨骼、腎臟和子代鼠血液、腦、腎臟等重要組織器官的蓄積降低(p0.05),母鼠及子代鼠的腸道及腦組織的病理損傷得到有效緩解,子代鼠肝臟及腎臟中NO的活性也顯著降低(p0.05),同時(shí)子代鼠腸道菌群的多樣性及菌群組成得到恢復(fù)。四、結(jié)論本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建母鼠鉛暴露致子代鼠鉛中毒的動物模型,并從健康新生兒糞便分離獲得一株具有自主知識產(chǎn)權(quán)的吸附鉛能力強(qiáng)的干酪乳桿菌SYF-08,該菌對鉛暴露母鼠及鉛中毒子代鼠均具有保護(hù)作用,可作為防治鉛中毒的功能性食品或藥品進(jìn)行下一步開發(fā)。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R595.2
【圖文】：

Ｆｉｇｕｒｅ邋１－３邋Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ邋ｏｆ邋ｏｘｉｄａｔｉｖｅ邋ｓｔｒｅｓｓ邋ｒｅｌａｔｅｄ邋ｆａｃｔｏｒｓ邋ｉｎ邋ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ’ｓ邋ｌｉｖｅｒ逡逑４．腸組織病理結(jié)果逡逑對子代鼠小腸進(jìn)行ＨＥ染色，結(jié)果顯示（圖１－４），Ｐｂ組子代鼠小腸病理損逡逑傷嚴(yán)重，腸上皮細(xì)胞的標(biāo)志性空泡消失、排列疏松，胞核移動至胞質(zhì)中間，無逡逑極性；杯狀細(xì)胞體積變小、數(shù)量減少；小腸腺萎縮；中央乳糜管變窄甚至消失。逡逑干預(yù)組ＬＧＧ．Ｐｂ小腸的病理損傷減輕，腸上皮細(xì)胞排列緊密，胞核極性正常；杯逡逑狀細(xì)胞及中央乳糜管形態(tài)恢復(fù)正常。提示ＬＧＧ干預(yù)后

Ｆｉｇｕｒｅ邋１－４邋Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ邋ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ’ｓ邋ｓｍａｌｌ邋ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ（２０0ｘ）逡逑５．腦組織病理結(jié)果逡逑對子代鼠腦組織進(jìn)行ＨＥ染色，結(jié)果顯示（圖１－５），Ｐｂ組子代鼠大腦皮層逡逑有明顯的病理損傷：出現(xiàn)彌漫性神經(jīng)元固縮、星形膠質(zhì)細(xì)胞增生水腫等病理損逡逑傷，并有不同程度的神經(jīng)元壞死現(xiàn)象。干預(yù)組ＬＧＧ．Ｐｂ的病理損傷有所恢復(fù)，大逡逑腦皮層細(xì)胞排列緊密，小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞增生、水腫情況明顯減少，逡逑少有神經(jīng)元細(xì)胞壞死。說明，ＬＧＧ干預(yù)母鼠鉛暴露可緩解子代鼠大腦皮層的病逡逑１８逡逑

逡逑圖１－４各組子代鼠小腸的結(jié)構(gòu)（２００Ｘ）邋Ａ．ＮＣ組Ｂ．Ｐｂ組ＣNＧＧ．Ｐｂ組逡逑ＤNＧＧ組（小箭頭示小腸腺萎縮，大箭頭示中央乳糜管消失，圓圈部分示小腸逡逑上皮細(xì)胞細(xì)胞核極性偏移。）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－４邋Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ邋ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ’ｓ邋ｓｍａｌｌ邋ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ（２０0ｘ）逡逑５．腦組織病理結(jié)果逡逑對子代鼠腦組織進(jìn)行ＨＥ染色，結(jié)果顯示（圖１－５），Ｐｂ組子代鼠大腦皮層逡逑有明顯的病理損傷：出現(xiàn)彌漫性神經(jīng)元固縮、星形膠質(zhì)細(xì)胞增生水腫等病理損逡逑傷，并有不同程度的神經(jīng)元壞死現(xiàn)象。干預(yù)組ＬＧＧ．Ｐｂ的病理損傷有所恢復(fù)，大逡逑腦皮層細(xì)胞排列緊密，小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞增生、水腫情況明顯減少，逡逑少有神經(jīng)元細(xì)胞壞死。說明，ＬＧＧ干預(yù)母鼠鉛暴露可緩解子代鼠大腦皮層的病逡逑１８逡逑

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