【摘要】：糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一種以持續(xù)的高血糖為基本特征的慢性全身性代謝疾病,是由于多種病因引起的胰島素抵抗或胰島素分泌絕對或相對不足而引起血糖升高的代謝紊亂性疾病。胰島素是胰腺β細(xì)胞合成的一種調(diào)節(jié)血糖的激素,除了降低血糖外,胰島素還可以抑制胰高血糖素的分泌。SP是速激肽家族的一員,是一個(gè)11個(gè)氨基酸的肽。SP可以直接發(fā)揮作用或與神經(jīng)激肽1(NK-1)受體結(jié)合后發(fā)揮其作用。SP也被發(fā)現(xiàn)作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的痛覺敏感神經(jīng)遞質(zhì),作為外周組織的損傷信使和免疫調(diào)節(jié)劑。有研究表明,非肥胖糖尿病(NOD)小鼠注射SP后,胰島素抵抗,慢性炎癥胰島細(xì)胞和糖尿病癥狀被逆轉(zhuǎn)。GLP-1是一種主要由L細(xì)胞分泌的肽類物質(zhì),GLP-1在促進(jìn)胰島素的合成和分泌中起重要作用,它可以抑制β細(xì)胞凋亡,提高細(xì)胞的增殖和再生,減少胰高血糖素的分泌,延緩胃排空,減少食物的攝入,促進(jìn)外周組織和減少肝糖輸出,增加對葡萄糖的利用。GLP-1發(fā)揮降血糖作用是在較高血糖水平下,而在正常情況下則不起作用。這種葡萄糖濃度依賴的降糖特點(diǎn)顯著減少了在降糖過程中低血糖情況的發(fā)生,是一種新型安全有效的降糖方式。因此,尋找一種安全有效的提高GLP-1濃度的方法顯得尤為重要。在本研究中,我們研究了SP在大鼠胰島團(tuán)中的潛在功能。研究表明,SP作用于胰腺神經(jīng)系統(tǒng)與胰島α細(xì)胞的NK-1受體上。SP可能是治療糖尿病的一種很有前途的治療策略。實(shí)驗(yàn)材料及方法:第一部分:糖尿病大鼠胰腺內(nèi)P物質(zhì)的含量變化及其意義健康SD大鼠,體重200-250 g,高脂高糖喂養(yǎng)后注射STZ建立二型糖尿病大鼠模型。烏拉坦麻醉后分離胰腺,顯微解剖其胰腺神經(jīng)節(jié),免疫熒光雙染PGP9.5和SP(Substance P)。比較正常組和糖尿病組胰腺神經(jīng)節(jié)內(nèi)SP表達(dá)的變化。western blot和ELISA檢測正常組和糖尿病組胰腺內(nèi)SP蛋白表達(dá)的變化。第二部分:P物質(zhì)對胰島調(diào)控的研究分離純化大鼠胰島團(tuán),通過FDA/PI雙染來選出最優(yōu)的SP處理濃度后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。將其放入24孔板中培養(yǎng),分成4組:空白對照組、SP培養(yǎng)組、L-703,606處理組和L-703,606處理2小時(shí)后SP培養(yǎng)組,每孔20-30個(gè)胰島團(tuán)。用ELISA試劑盒來檢測胰島團(tuán)胰島素,GLP-1及胰高血糖素的分泌情況。并制作冰凍切片進(jìn)行NK-1R及α細(xì)胞免疫熒光染色。結(jié)果:第一部分:糖尿病大鼠胰腺內(nèi)P物質(zhì)的含量變化及其意義糖尿病大鼠胰腺神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中SP陽性表達(dá)的占21.3%±1.7%,與正常大鼠性比較(34.0%±1.2%,n=13)有減少(p0.05)。糖尿病組SP表達(dá)為76.7±11.6%(n=5),對照組SP表達(dá)為103±10.7%(n=5),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。糖尿病組SP含量為1903.3±125.2 pg/ml(n=5),正常組SP含量為2989.72±101.3 pg/ml(n=5),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。第二部分:P物質(zhì)對胰島調(diào)控的研究胰島團(tuán)分別用含有SP與不含有SP的培養(yǎng)基培養(yǎng)三天后,收集上清進(jìn)行Elisa檢測。加入SP培養(yǎng)后,SP處理組胰島素釋放量(3.6±0.2μIU/IEQ,n=5,p0.05)與空白組(2.8±0.3μIU/IEQ,n=5,)比較顯著升高,GLP-1分泌量(6.3±0.4 pM/IEQ,n=5,p0.05)與空白組(4.3±0.3 pM/IEQ,n=5)比較明顯增加,胰高血糖素分泌量(31.2±9.4 pM/IEQ,n=5,p0.05)與空白組(43.9±11.7 pM/IEQ,n=5)略有減少,但兩組間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在加入SP受體NK-1R抑制劑L-703,606后,胰島素釋放量(2.6±0.1μIU/IEQ,n=5,p0.05)與SP組(3.6±0.2μIU/IEQ,n=5,)比較顯著減少,GLP-1分泌量(4.2±0.5 pM/IEQ,n=5,p0.05)與SP組(6.3±0.4 pM/IEQ,n=5)比較明顯減少,胰高血糖素分泌量(22.8±6.4 pM/IEQ,n=5,p0.05)與SP組(31.2±9.3 pM/IEQ,n=5)相比略有減少,但兩組間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在SP條件下與低糖(2.7Mm)培養(yǎng)環(huán)境相比(2.6±0.7 pM/IEQ,n=3),高糖(16.7 Mm)條件下GLP-1分泌量(11.7±2.1 pM/IEQ,n=3,p0.05)明顯增加,且24小時(shí)之內(nèi)分泌量隨著時(shí)間的延長增加。免疫熒光結(jié)果顯示胰腺神經(jīng)系統(tǒng)與胰島有著密切的聯(lián)系,且在胰島α細(xì)胞上由NK-1受體的表達(dá)。結(jié)論:在糖尿病病理狀態(tài)下,胰腺與胰腺神經(jīng)節(jié)中的SP表達(dá)均減少。在胰島細(xì)胞中,SP對胰島細(xì)胞有保護(hù)作用且可以促進(jìn)其胰島素的分泌,可能的機(jī)制是通過作用于α細(xì)胞的NK-1受體促進(jìn)GLP-1的分泌導(dǎo)致。
【圖文】：

糖尿病大鼠胰腺神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元 SP 的表達(dá)（×200）。綠色熒光為 PGP9.5，標(biāo)記所有神經(jīng)元，紅色熒光為 SP，白色箭頭所指為胰腺神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元。3.2 正常大鼠與糖尿病大鼠胰腺內(nèi) SP 蛋白表達(dá)用 western blot 分析兩組大鼠胰腺內(nèi) SP 的蛋白表達(dá)異同。糖尿病大鼠胰腺內(nèi)SP 和正常大鼠比較有顯著的降低，結(jié)果顯示見圖 2。通過光密度值計(jì)算，糖尿病組 SP 表達(dá)為 76.7±11.6% (n=5)，對照組 SP 表達(dá)為 103±10.7% (n=5)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），結(jié)果顯示見圖 3。

. 糖尿病大鼠與正常大鼠胰腺內(nèi) SP 的表達(dá)蛋白灰度值比較。#：p<0.05 (n大鼠與糖尿病大鼠胰腺內(nèi) SP 含量ISA 法定量分析兩組大鼠胰腺內(nèi) SP 的蛋白含量變化，，結(jié)果顯示見胰腺內(nèi) SP 和正常組比較有顯著的降低，糖尿病大鼠胰腺內(nèi) SP5.2 pg/ml(n=5)，正常大鼠胰腺內(nèi) SP 含量為 2989.72±101.3 pg/ml學(xué)意義（P<0.05）。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R587.1

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本文編號：2680490