【摘要】：背景糖尿病皮膚潰瘍是糖尿病患者由于神經(jīng)血管病變導(dǎo)致微循環(huán)障礙而發(fā)生的潰瘍和壞疽,往往遷延難愈,使患者預(yù)期壽命及生活質(zhì)量顯著下降。然而,糖尿病傷口愈合延遲或缺乏愈合的原因仍不清楚,并且可加速或促進(jìn)其修復(fù)的治療方法仍然有限。內(nèi)皮細(xì)胞在血管生成中起重要作用,在血管生成時(shí),血管內(nèi)皮細(xì)胞被快速激活并遷移到遠(yuǎn)處位點(diǎn)進(jìn)行增殖,從現(xiàn)有毛細(xì)血管形成新的初級(jí)毛細(xì)血管以促進(jìn)組織修復(fù),內(nèi)皮功能障礙是糖尿病微血管和大血管并發(fā)癥的基礎(chǔ)。外泌體和mi RNA是參與糖尿病發(fā)病機(jī)制的重要分子,這些分子可以通過(guò)靶向參與糖尿病發(fā)病不同階段的細(xì)胞和分子途徑來(lái)發(fā)揮其作用。已經(jīng)有研究報(bào)道,內(nèi)皮祖細(xì)胞分泌的外泌體對(duì)血管內(nèi)皮損傷的修復(fù)作用,但其具體分子機(jī)制仍未闡明。目的(1)探究?jī)?nèi)皮祖細(xì)胞外泌體和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞外泌體mi RNA表達(dá)譜及差異。(2)明確內(nèi)皮祖細(xì)胞外泌體對(duì)糖尿病皮膚損傷的修復(fù)作用。(3)探究?jī)?nèi)皮祖細(xì)胞外泌體中包含的mi RNA-221-3p對(duì)糖尿病皮膚損傷的修復(fù)作用和機(jī)制。方法(1)細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)將誘導(dǎo)成的內(nèi)皮祖細(xì)胞孵育CD133、Fl K-1抗體,然后孵育二抗,用熒光顯微鏡觀察免疫熒光情況。(2)內(nèi)皮祖細(xì)胞外泌體和臍靜脈細(xì)胞外泌體mi RNA高通量測(cè)序分別從原代培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細(xì)胞和臍靜脈細(xì)胞提取的外泌體,進(jìn)行mi RNA建庫(kù)和上機(jī)測(cè)序后,將原始數(shù)據(jù)過(guò)濾后使用相應(yīng)軟件進(jìn)行定性和定量。(3)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)將胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞使用mi RNA-221-3p轉(zhuǎn)染處理后12小時(shí)在顯微鏡下進(jìn)行觀察和拍攝,觀察細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)及遷移能力改變。(4)免疫組化實(shí)驗(yàn)將對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠處死,取傷口愈合處真皮層皮膚組織進(jìn)行免疫組化,觀察真皮層CD31、Ki67、VEGF和PCNA表達(dá)量的改變情況。結(jié)果(1)免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,兩個(gè)標(biāo)志性蛋白CD133和Fl K-1皆呈陽(yáng)性,顯示內(nèi)皮祖細(xì)胞被誘導(dǎo)分化成功。(2)通過(guò)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞外泌體mi RNA高通量測(cè)序結(jié)果顯示,內(nèi)皮祖細(xì)胞外泌體與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞外泌體在mi RNA表達(dá)譜上有明顯差異,并通過(guò)差異靶基因的功能和信號(hào)通路分析,顯示出內(nèi)皮祖細(xì)胞外泌體mi RNA的主要功能。(3)通過(guò)構(gòu)建小鼠皮膚損傷模型,涂抹內(nèi)皮祖細(xì)胞外泌體或mi RNA-221-3p觀察皮膚愈合情況,發(fā)現(xiàn)外泌體和mi RNA-221-3p都可以促進(jìn)正常小鼠和糖尿病小鼠傷口愈合。(4)免疫組化結(jié)果顯示,內(nèi)皮祖外泌體和mi RNA-221-3p孵育后的糖尿病皮膚損傷模型的皮膚處CD31、Ki67、VEGF和PCNA顯著增加,并且新生血管增多。(5)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,mi RNA-221-3p可以顯著增強(qiáng)胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力。結(jié)論(1)內(nèi)皮祖細(xì)胞外泌體和mi RNA-221-3p可以促進(jìn)糖尿病小鼠傷口愈合,并且導(dǎo)致CD31,Ki67、VEGF和PCNA蛋白表達(dá)增加,新生血管生成增加。(2)mi RNA-221-3p可以促進(jìn)胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力。
【圖文】：

安徽醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文20行免疫熒光實(shí)驗(yàn)鑒定，結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯示CD133呈陽(yáng)性，F(xiàn)lK-1也呈強(qiáng)陽(yáng)性，這說(shuō)明小鼠原代內(nèi)皮祖細(xì)胞被成功的誘導(dǎo)分化。圖1：原代培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細(xì)胞FlK-1、CD133免疫熒光鑒定（×200）Fig 1. The FlK-1 and CD133 of the differentiated endothelial progenitor cells werestrongly positive（×200）3.2 內(nèi)皮祖細(xì)胞和臍靜脈細(xì)胞外泌體 miRNAs 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)的初步分析結(jié)果我們一共檢測(cè) 8 個(gè)樣本，包括四個(gè)內(nèi)皮祖細(xì)胞和四個(gè)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞外泌體miRNA 。 編 號(hào) 分 別 是 EPCs-Exo1 ， EPCs-Exo2 ， EPCs-Exo3 ， EPCs-Exo4 ，HUVCEs-Exo1

TypeEPCs-Exo 1EPCs-Exo 2EPCs-Exo 3EPCs-Exo4HUVCEs-Exo1HUVCEs-Exo2HUVCEs-Exo3HUVCEs-Exo4Total_reads 13006725 1405817814232291 16826016 13475955 12925316 12849858 14576043Clean_reads 12394166 1353231213777508 16287231 12842966 12441322 12278390 13798049Size 304 M 334 M 331 M 379 M 317 M 304 M 304 M 340 M% 95.74% 96.63% 97.18% 97.17% 95.75% 96.70% 96.07% 95.16%表 1：Raw data 過(guò)濾結(jié)果Tab1. Filtered data3.3 內(nèi)皮祖細(xì)胞和臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞外泌體 miRNAs 數(shù)據(jù)的質(zhì)檢報(bào)告為了判斷過(guò)濾后數(shù)據(jù)是否屬于高質(zhì)量數(shù)據(jù)，我們通過(guò)常用的質(zhì)量檢測(cè)軟件FastQC 對(duì) Clean data 進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)量檢控。并且使用 Multiqc（v.1.6）軟件進(jìn)行整合，結(jié)果如圖 4 所示，我們發(fā)現(xiàn)所有的堿基質(zhì)量都位于 Q30 之上，這說(shuō)明我們獲得了高質(zhì)量的 reads，并且完全可以用于下一步的分析。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R587.1

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 Tsay HC;張笑晨;胡玉琳;;特異性抑制肝細(xì)胞miRNA-221-3p可減輕肝纖維化[J];臨床肝膽病雜志;2019年05期

2 邱玲;馮建國(guó);楊繼梅;李茂;王曉斌;;血清miRNA-221-3p標(biāo)準(zhǔn)品的制備及其絕對(duì)含量測(cè)定[J];西南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2017年06期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前3條

1 方陽(yáng);內(nèi)皮祖細(xì)胞與臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞外泌體miRNA表達(dá)譜差異及miRNA-221-3p對(duì)糖尿病小鼠皮膚傷口愈合的促進(jìn)作用研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2019年

2 周瑤;miRNA-221-3p在肥大細(xì)胞分泌過(guò)程中作用及機(jī)制研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2014年

3 徐紅;miRNA-221-3p對(duì)肥大細(xì)胞脫顆粒功能的影響及機(jī)制的研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2015年

，

本文編號(hào)：2671746