【摘要】：支氣管哮喘是以氣道炎癥為主要病理特征的氣道疾病之一。近20年來,支氣管哮喘的發(fā)病率持續(xù)增加,全球支氣管哮喘患者人數(shù)已逾3億。研究發(fā)現(xiàn)TLR2信號(hào)通路調(diào)控炎癥因子釋放,參與哮喘的發(fā)病機(jī)理。利多卡因可以明顯改善哮喘患者的氣道炎癥,減少激素的使用。本研究中,我們采用小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7為研究對(duì)象,在細(xì)胞水平觀察利多卡因?qū)鹌暇T導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞TLR2表達(dá)的影響。然后以O(shè)VA致敏和激發(fā)的過敏性小鼠為研究對(duì)象,觀察利多卡因?qū)^敏性小鼠肺部炎癥及肺組織內(nèi)TLR2表達(dá)的影響。同時(shí)我們使用了TLR2激動(dòng)劑預(yù)處理的野生型小鼠及TLR2基因敲除小鼠,進(jìn)一步探討霧化吸入利多卡因抑制過敏性氣道炎癥的機(jī)制。研究目的1、研究利多卡因?qū)鹌暇腥镜木奘杉?xì)胞TLR2及下游潛在信號(hào)級(jí)聯(lián)活化的影響。2、研究霧化吸入利多卡因?qū)^敏性小鼠肺組織炎癥及TLR2信號(hào)通路的影響。3、研究利多卡因?qū)^敏性小鼠炎癥小體活化的影響。研究方法1、檢測(cè)利多卡因?qū)鹌暇腥镜木奘杉?xì)胞TLR2信號(hào)通路活化的影響小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7以2.5×105/孔的密度種植于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,采用不同濃度的利多卡因預(yù)處理24h,金葡菌刺激1h后收取培養(yǎng)上清液和細(xì)胞。采用免疫印跡法檢測(cè)TLR2及下游蛋白的表達(dá);2、霧化吸入利多卡因?qū)^敏性小鼠肺部炎癥及肺內(nèi)TLR2蛋白表達(dá)的影響C57BL/6雌性小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(Con組),哮喘組(OVA組),利多卡因治療組(OVA+1%Lido組)。留取小鼠肺組織及肺泡灌洗液。HE及PAS染色觀察小鼠氣道炎癥、杯狀細(xì)胞及粘液分泌情況;瑞士吉姆薩染色計(jì)數(shù)肺泡灌洗液中的炎癥細(xì)胞數(shù)目;ELISA試劑盒檢測(cè)小鼠肺泡灌洗液中IL-13、IL-6、TNF-α和IFN-γ的濃度;免疫印跡法檢測(cè)肺組織中TLR2蛋白表達(dá)水平。3、霧化吸入利多卡因?qū)am3CSK4預(yù)處理的過敏性小鼠肺部炎癥的影響致敏及激發(fā)前2h腹腔注射TLR2激動(dòng)劑Pam3CSK4預(yù)處理C57BL/6雌性小鼠。留取肺泡灌洗液及肺組織標(biāo)本。HE及PAS染色觀察小鼠氣道炎癥、杯狀細(xì)胞及粘液分泌情況;瑞士吉姆薩染色計(jì)數(shù)肺泡灌洗液中的炎癥細(xì)胞數(shù)目;ELISA試劑盒檢測(cè)小鼠肺泡灌洗液中IL-13、IL-6、TNF-α和IFN-γ的濃度;免疫印跡法檢測(cè)肺組織中TLR2蛋白表達(dá)水平。4、霧化吸入利多卡因?qū)LR2基因敲除過敏性小鼠肺部炎癥的影響OVA致敏和激發(fā)TLR2基因敲除小鼠建立模型,留取小鼠肺組織及肺泡灌洗液。HE及PAS染色觀察小鼠氣道炎癥、杯狀細(xì)胞及粘液分泌情況;瑞士吉姆薩染色計(jì)數(shù)肺泡灌洗液中的炎癥細(xì)胞數(shù)目;ELISA試劑盒檢測(cè)小鼠肺泡灌洗液中IL-13、IL-6、TNF-α和IFN-γ的濃度;免疫印跡法檢測(cè)肺組織中TLR2蛋白表達(dá)水平。5、霧化吸入利多卡因?qū)^敏性小鼠炎癥小體活性的影響OVA致敏和激發(fā)野生型小鼠。留取小鼠外周血、肺組織及肺泡灌洗液。小鼠血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)小鼠外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類計(jì)數(shù);ELISA試劑盒檢測(cè)小鼠肺泡灌洗液及血清中IL-4、IL-18和Ig E的濃度;免疫印跡法檢測(cè)肺組織中NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白表達(dá)水平。研究結(jié)果1、利多卡因抑制金葡菌誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞TLR2信號(hào)通路活化小鼠單核巨噬細(xì)胞系在金葡菌刺激下TLR2、NF-κBp65和NLRP3的表達(dá)明顯增高,利多卡因呈濃度依賴性的抑制TLR2、NF-κBp65和NLRP3的表達(dá),且此抑制作用在利多卡因濃度為200μg/ml組最顯著。2、霧化吸入利多卡因顯著抑制OVA誘發(fā)的氣道炎癥及肺內(nèi)TLR2的表達(dá)與Con組相比,OVA刺激后,小鼠支氣管周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),管壁增厚,部分小氣道塌陷,粘膜下上皮杯狀細(xì)胞增生,粘液分泌增加,肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞及IL-13、IL-6、TNF-α和IFN-γ的水平顯著升高。與OVA組相比,霧化吸入利多卡因顯著降低小鼠肺組織支氣管周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),杯狀細(xì)胞及粘液分泌明顯減少,肺泡灌洗液中的炎癥細(xì)胞及炎癥因子濃度顯著下調(diào)。與Con組相比,OVA刺激后小鼠肺組織內(nèi)的TLR2、NF-κBp65和NLRP3的表達(dá)均明顯升高,霧化吸入利多卡因明顯降低哮喘小鼠肺組織內(nèi)的TLR2、NF-κBp65和NLRP3的表達(dá)。3、霧化吸入利多卡因明顯抑制Pam3CSK4預(yù)處理的過敏性小鼠肺部炎癥Pam3CSK4預(yù)處理顯著加重野生型過敏性小鼠的肺部炎癥,主要表現(xiàn)在小鼠支氣管周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度、粘膜下上皮杯狀細(xì)胞增生及粘液分泌量、肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞及炎癥因子濃度均較未經(jīng)Pam3CSK4預(yù)處理的過敏性小鼠顯著增高。霧化利多卡因能徹底抑制OVA激發(fā)的Pam3CSK4預(yù)處理的過敏性小鼠肺部炎癥。Pam3CSK4預(yù)處理顯著提高過敏性小鼠肺組織內(nèi)的TLR2、NF-κBp65和NLRP3的表達(dá),霧化吸入利多卡因徹底抑制Pam3CSK4預(yù)處理的過敏性小鼠肺組織內(nèi)的TLR2、NF-κBp65和NLRP3的表達(dá)。4、霧化吸入利多卡因不能進(jìn)一步抑制OVA誘導(dǎo)的TLR2基因敲除小鼠肺部炎癥OVA致敏激發(fā)后,TLR2-/-小鼠與野生型小鼠相比,支氣管周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn),上皮下杯狀細(xì)胞增生,粘液分泌等氣道炎癥表現(xiàn)均明顯減弱,肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞數(shù)量明顯減少,IL-13、IL-6、TNF-α和IFN-γ表達(dá)明顯下調(diào)。而霧化吸入利多卡因則不能進(jìn)一步降低OVA刺激的TLR2-/-小鼠肺部炎癥。OVA致敏激發(fā)后,TLR2-/-小鼠與野生型小鼠相比,肺組織中的NF-κBp65和NLRP3蛋白的表達(dá)水平減弱。霧化吸入利多卡因則不能進(jìn)一步降低肺組織中NF-κBp65和NLRP3蛋白的表達(dá)水平。5、霧化吸入利多卡因僅抑制過敏性小鼠肺組織中NLRP3和ASC的表達(dá)與Con組相比,OVA刺激后,小鼠外周血白細(xì)胞總數(shù)及淋巴細(xì)胞數(shù)明顯增高,肺泡灌洗液中IL-4水平及血清中Ig E水平明顯增高。與OVA組相比,霧化吸入利多卡因顯著降低小鼠外周血白細(xì)胞總數(shù)及淋巴細(xì)胞數(shù),且肺泡灌洗液中IL-4水平及血清中Ig E水平明顯著下調(diào)。與Con組相比,OVA刺激后小鼠肺組織內(nèi)的NLRP3和ASC的表達(dá)均明顯升高,但肺組織中caspase-1和IL-1β蛋白的表達(dá)以及BALF中IL-18的水平并沒有明顯增加。霧化吸入利多卡因明顯降低哮喘小鼠肺組織內(nèi)的NLRP3和ASC的表達(dá)。研究結(jié)論1、利多卡因抑制金葡菌誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞TLR2信號(hào)通路的活化。2、霧化吸入利多卡因通過抑制TLR2信號(hào)通路活化來降低小鼠變應(yīng)性氣道炎癥。3、利多卡因抑制Th2應(yīng)答和NLRP3表達(dá)改善哮喘小鼠的氣道炎癥。
【圖文】：

1h時(shí)TLR2信號(hào)通路活化明顯），，然后采用Western Blot的實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平。NF-κ Bp65在TLR2信號(hào)通路中起到關(guān)鍵性作用。TLR2激活后活化NF-κ Bp65，活化的NF-κ Bp65能夠激活下游的NLRP3，從而放大炎癥級(jí)聯(lián)[14]。如圖1（A-D）所示，金葡菌刺激RAW264.7細(xì)胞誘導(dǎo)了TLR2、NF-κ Bp65和NLRP3的活化，而利多卡因呈濃度依賴性的抑制TLR2信號(hào)通路的活化，在200 ng/ml濃度時(shí)對(duì)TLR2信號(hào)通路抑制最顯著。

發(fā)現(xiàn)Pam3CSK4預(yù)處理能顯著提高金葡菌誘導(dǎo)的TLR2信號(hào)通路的活化，而200μg/ml的利多卡因預(yù)處理降低了Pam3CSK4增強(qiáng)的TLR2，P-NF-κBp65和NLRP3的表達(dá)（圖2A-D）。圖 2 利多卡因明顯抑制TLR2激動(dòng)劑Pam3CSK4及金葡菌誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞TLR2信號(hào)通路的活化。（A）TLR2激動(dòng)劑Pam3CSK4（1μg/ml）及200ng/ml的利多卡因預(yù)處理RAW264.7細(xì)胞24小時(shí)，再給予RAW264.7細(xì)胞金葡菌刺激1小時(shí)。收集
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R562.25

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本文編號(hào)：2637935