【摘要】：目的體外分離培養(yǎng)大鼠脂肪干細(xì)胞(Adipose derived stem cells,ASCs),制備脂肪干細(xì)胞來(lái)源的條件培養(yǎng)基(Adipose derived stem cells conditioned medium,ASCs-CM),探討ASCs-CM對(duì)皮膚成纖維細(xì)胞的增殖、遷移及向肌成纖維細(xì)胞分化功能的影響。另外,通過(guò)體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀(guān)察ASCs-CM對(duì)糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面愈合的影響。方法取健康SD大鼠脂肪組織,采用酶消化法分離培養(yǎng)ASCs,通過(guò)細(xì)胞免疫熒光染色法鑒定脂肪干細(xì)胞。收集第5代ASCs的條件培養(yǎng)基,用超濾離心管進(jìn)行濃縮,獲得ASCs-CM。將成纖維細(xì)胞分為ASCs-CM組與低糖培養(yǎng)基組,分別記為處理組(ASCs-CM)和對(duì)照組(N-CM)。通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)觀(guān)察ASCs-CM對(duì)成纖維細(xì)胞增殖和遷移功能的影響;通過(guò)Western Blot實(shí)驗(yàn)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)ASCs-CM對(duì)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化功能的影響。用鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病SD大鼠模型,成模后將大鼠隨機(jī)分為ASCs-CM組和N-CM組,并制備糖尿病大鼠全層皮膚創(chuàng)面模型,在創(chuàng)面周?chē)謩e注射ASCs-CM或N-CM 0.5mL。分別在術(shù)后第4、8、12和16天測(cè)量殘余創(chuàng)面面積,并取部分創(chuàng)面組織分別進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色和qRT-PCR檢測(cè)α-SMA與TGF-β1的表達(dá)。結(jié)果本實(shí)驗(yàn)成功分離脂肪干細(xì)胞,通過(guò)免疫熒光鑒定,符合脂肪干細(xì)胞的特性。CCK-8實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,ASCs-CM能顯著促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖與遷移。同時(shí),Western blot和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)均驗(yàn)證了ASCs-CM能促進(jìn)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示,ASCs-CM組在術(shù)后的第4、8、12和16天的創(chuàng)面愈合率均顯著高于N-CM組,差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫組織化學(xué)染色和qRT-PCR結(jié)果顯示,在術(shù)后的第4天,ASCs-CM組的α-SMA表達(dá)高于N-CM組(P0.05);在術(shù)后的第4、8和12天,TGF-β1的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論本課題研究證明脂肪干細(xì)胞條件培養(yǎng)基可能通過(guò)促進(jìn)創(chuàng)面中TGF-β1的分泌以及促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖、遷移與分化從而加速了糖尿病SD大鼠的創(chuàng)面愈合。
【圖文】：

PCR擴(kuò)增程序

顯微鏡下觀(guān)察第三代脂肪干細(xì)胞形態(tài)
【學(xué)位授予單位】：錦州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R587.2

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本文編號(hào)：2637661