【摘要】：【研究目的】研究錳染毒后大鼠紋狀體基因表達譜的改變,探討錳致多巴胺能神經(jīng)元損傷的分子機制,進一步探索錳中毒發(fā)生的基因靶點,尋求錳中毒生物治療途徑�！狙芯糠椒ā�1.本研究采用以25mg/kg MnCl_2·4H_2O,0.2ml/100g進行腹腔注射,每48h注射一次,對SD大鼠暴露1個月后冰上取大鼠腦紋狀體組織并立即倒入液氮,提取紋狀體RNA并檢測總RNA濃度、RNA完整性數(shù)(RIN)28S/18S值和片段大小,建立基因文庫。2.采用Agilent 2100 Bioanalyzer及ABI StepOnePlus Real-Time PCR System兩種方法對基因文庫進行檢測,Agilent2100 Bioanalyzer檢測文庫的插入片段范圍,ABI StepOnePlus Real-Time PCR System對文庫進行濃度的定量。同時進行數(shù)據(jù)的過濾,去除接頭污染、未知堿基過高及低質(zhì)量讀數(shù),獲得清潔讀數(shù)(clean reads)。3.使用HISAT將clean reads比對到參考基因組序列。與參考基因組比對之后,使用StringTie對每個樣品進行轉(zhuǎn)錄本重構(gòu),然后使用Cuffcompare將重構(gòu)的轉(zhuǎn)錄本與參考注釋信息比較,挑選新轉(zhuǎn)錄本,并用CPC軟件對新轉(zhuǎn)錄本進行編碼潛力的預測,最終將預測具有蛋白編碼潛力的新轉(zhuǎn)錄本加入到參考基因序列中,得到一個完整的參考序列信息,后續(xù)基于此參考序列進行分析。4.使用DEseq2和PossionDis兩種算法進行差異基因檢測,篩選FDR≤0.001且倍數(shù)差異在2倍以上的基因,定義為差異表達基因。利用GO功能及KEGG數(shù)據(jù)庫進一步對差異表達基因進行功能性分析,并利用String數(shù)據(jù)庫篩選差異表達基因的互作基因并進行相關(guān)分析。5.對篩選出的差異表達基因及其互作基因進行RT-PCR驗證,對比全基因組分析及PCR驗證實驗結(jié)果,分析差異表達基因可能的分子調(diào)控機制�！狙芯拷Y(jié)果】1.建庫測序之前對各個樣品進行質(zhì)量檢測,本研究各個樣品,濃度均達到50ng/μl,RIN值均大于8.0,28S/18S均大于1.3,RNA總量充足,無DNA、蛋白/鹽離子等污染,樣品無色透明不粘稠,說明樣品符合測序質(zhì)量檢測標準,可以建立基因文庫。2.使用Illumina HiSeq平臺進行檢測,平均每個樣品生成6.72Gb數(shù)據(jù)。樣品比對到基因組的平均比對率為88.12%,基因文庫中各樣品Clean Reads Q20(%)值均大于98%,Clean Reads Q30(%)值均大于95%,表明測序質(zhì)量良好。3.共篩選出17個差異表達基因,其中7個基因顯著下調(diào),10個基因顯著上調(diào),差異基因中僅有5個基因為已知基因,分別為:Sgk1、Pnpla1、Grm2、HCRTr1、RT1-CE16,其他基因為未知的新基因。GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)差異表達基因在行為功能部分富集程度最高(P=0.02281)。Pathway功能富集發(fā)現(xiàn)差異基因多富集在神經(jīng)活性配體-受體相互作用、谷氨酸能代謝等神經(jīng)傳導途徑以及FoxO信號通路、PI3K-Akt信號通路、mTOR信號通路等細胞凋亡途徑。4.根據(jù)基因功能及互作效應篩選出HspB1,Rem2,Oprd1,ATF5以及TRHr五個基因可能參與錳中毒致病機制,上述基因與其互作差異基因的互作得分分別為:726、907、231、191、900。RT-PCR驗證實驗與基因測序結(jié)果基本一致,但Sgk1、Pnpla1、ATF5以及TRHr驗證結(jié)果無統(tǒng)計學差異(P0.05)。5.差異基因與互作基因相關(guān)性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)Rem2和TRHr均與HCRTr1顯著相關(guān),Rem2與HCRTr1呈負相關(guān)關(guān)系(r=-0.782,P0.05),TRHr與HCRTr1呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.707,P0.05),Rem2和TRHr之間也為負相關(guān)關(guān)系(r=-0.651,P0.05)。RT1-CE16與Oprd1之間存在負相關(guān)關(guān)系(r=-0.502,P0.05)。未知基因novel_G001016的兩個互作基因HspB1與ATF5之間無相關(guān)性�！狙芯拷Y(jié)論】1.篩選的17個差異基因,初步通過GO分析、Pathway功能分析確定基因功能,發(fā)現(xiàn)差異基因涉及PI3K-Akt、mTOR、FoxO等細胞凋亡相關(guān)通路以及谷氨酸代謝、神經(jīng)活性受體-配體作用等。2.利用String數(shù)據(jù)庫,觀察差異基因的互作基因,推測HspB1、Rem2、Oprd1、ATF5、TRHr基因可能參與錳中毒致病機制。3.全基因組測序與RT-PCR驗證結(jié)果基本一致,但個別基因驗證結(jié)果無統(tǒng)計學差異,考慮可能由于樣品個體差異的原因,還需重復實驗驗證。篩選出的錳中毒差異表達基因還需進一步功能實驗確定其表達調(diào)控機制以及對錳中毒的影響。
【圖文】：

錳中毒大鼠腦紋狀體基因表達差異分析樣品堿基質(zhì)量處于較高水平，表明測序質(zhì)量良好（表 2，圖 1）。表 2 紋狀體基因文庫過濾后 reads 質(zhì)量統(tǒng)計SampleTotal RawReads(Mb)Total CleanReads (Mb)Total CleanBases (Gb)Clean ReadsQ20 (%)Clean ReadsQ30 (%)Clean ReadsRatio (%)CS1 50.62 45.19 6.78 98.60 95.75 89.28CS2 50.25 45.35 6.80 98.47 95.41 86.78CS3 50.62 44.09 6.61 98.49 95.47 87.11ES1 52.25 45.15 6.77 98.44 95.34 86.40ES2 50.62 44.40 6.66 98.53 95.56 87.71ES3 50.62 44.62 6.69 98.56 95.64 88.14注：Sample 為樣品名；Total Raw Reads(Mb)代表過濾前的 reads 數(shù)；Total Clean Reads(Mb)表示過濾后的 reads 數(shù)；Total Clean Bases(Gb)為過濾后的堿基總數(shù)；Clean Reads Q20(%)是指過濾后的 reads 中質(zhì)量值大于 20 的堿基數(shù)占總堿基數(shù)的比例；Clean Reads Q30(%)是指過濾后的 reads 中質(zhì)量值大于 30 的堿基數(shù)占總堿基數(shù)的比例；Clean ReadRatio(%)為過濾后的 reads 比例。

錳中毒大鼠腦紋狀體基因表達差異分析50,670 49,800 100,470 10,081 9,059 8,849 10,075 38,064 51,498 51,160 102,658 10,708 9,326 9,108 10,457 39,599 50,404 50,114 100,518 10,099 9,125 8,734 10,135 38,093 56,179 55,964 112,143 11,528 10,349 9,874 11,298 43,049 發(fā)生轉(zhuǎn)換變異的 SNP 數(shù)目，，Transversion 指發(fā)生顛換變異的 SNP 數(shù)。
【學位授予單位】：濟南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R595.2

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本文編號：2600643