【摘要】：目的:在過去的二十年間,間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的免疫抑制功能受到了廣大學(xué)者的廣泛關(guān)注。其中,人臍帶源間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)以其來源豐富和無創(chuàng)性,成為分離獲得間充質(zhì)干細(xì)胞的重要來源。大量的研究報(bào)道顯示間充質(zhì)干細(xì)胞能夠通過細(xì)胞接觸和分泌可溶性調(diào)節(jié)物質(zhì)兩個(gè)途徑對B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞以及DC進(jìn)行免疫性調(diào)節(jié)。然而關(guān)于間充質(zhì)干細(xì)胞對具體的疾病尤其是食物過敏(food allergy,FA)的影響尚不清楚。本文利用小鼠OVA實(shí)驗(yàn)性食物過敏模型研究了人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對食物過敏小鼠臨床癥狀、腸道免疫功能及菌群的影響,從而探討間充質(zhì)干細(xì)胞對食物過敏疾病的潛在治療性應(yīng)用。方法:1.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的制備與鑒定(1)將臍帶組織洗盡剃去血管,剪成細(xì)碎的組織塊,按照一定密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿,放置37℃、含5%CO_2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。隔三天觀察并換液。當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)到約80%融合時(shí),用含胰蛋白酶和EDTA的消化液消化并繼續(xù)傳代。(2)取第二代臍帶源間充質(zhì)干細(xì)胞,采用表面抗體染色分析其細(xì)胞表面CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、CD14和HLA-DR抗原的表達(dá)。(3)將臍帶源間充質(zhì)干細(xì)胞按5×10~4個(gè)/cm_2接種于六孔板中。待細(xì)胞長至80%融合時(shí),分別換為成骨分化誘導(dǎo)液和成脂肪分化誘導(dǎo)液。隔天換液,成骨誘導(dǎo)至28天和成脂肪誘導(dǎo)第14天時(shí)分別進(jìn)行茜素紅染色和油紅O染色鑒定。2.間充質(zhì)干細(xì)胞對實(shí)驗(yàn)性食物過敏臨床癥狀的影響(1)將20只健康BALB/c實(shí)驗(yàn)鼠隨機(jī)分為四組:PBS組、FA組、FA+DMEM/F12組和FA+MSC組。分別進(jìn)行食物過敏誘導(dǎo)和相對應(yīng)的處理,記錄過程中小鼠腹瀉情況和體重變化情況。(2)食物過敏誘導(dǎo)和處理結(jié)束后,取出小鼠結(jié)腸組織觀察內(nèi)容物性狀并拍照。3.間充質(zhì)干細(xì)胞對小鼠腸道免疫功能的影響(1)收集小鼠血清,采用ELISA的方法檢測血清總IgE的含量。(2)流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠外周血以及腸系膜淋巴結(jié)中TH2細(xì)胞的比例。(3)熒光定量PCR法檢測結(jié)腸固有層IL-4和TNF-α分子水平的表達(dá)。(4)結(jié)腸組織切片進(jìn)行HE染色和PAS染色觀察腸絨毛和杯狀細(xì)胞變化。4.間充質(zhì)干細(xì)胞對腸道菌群的影響(1)食物過敏誘導(dǎo)及相應(yīng)治療處理結(jié)束后,收集小鼠結(jié)腸內(nèi)容物,利用高通量Miseq測序技術(shù)以及相關(guān)分析方法,定量分析腸道內(nèi)微生物結(jié)構(gòu)特征,包括OUT聚類分析、α和β多樣性分析。(2)將分析結(jié)果以門水平和屬水平分布作相對分度柱形圖。結(jié)果:(1)臍帶組織塊在培養(yǎng)12天左右,周圍出現(xiàn)梭形細(xì)胞生長。流式分析結(jié)果顯示細(xì)胞表面高表達(dá)CD73、CD90和CD105分子,但CD34、CD45、CD14和HLA-DR抗原呈陰性。體外誘導(dǎo)成骨、成脂肪培養(yǎng)后,細(xì)胞茜素紅染色有明顯鈣沉積物被染為紅色;油紅O染色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)脂滴被染為橘色或紅色。(2)統(tǒng)計(jì)各組小鼠食物過敏期間體重變化無明顯的差異。但是,分析各組小鼠腹瀉的發(fā)生比例,發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞處理組小鼠腹瀉發(fā)生較晚,腹瀉比例下降。同時(shí),食物過敏組與培養(yǎng)基對照組小鼠結(jié)腸內(nèi)容物不成形,而間充質(zhì)干細(xì)胞處理組則相對較成形。(3)食物過敏后,小鼠血清總IgE水平明顯增加,而間充質(zhì)干細(xì)胞處理后則發(fā)生顯著的下降;同時(shí)外周血與腸系膜淋巴結(jié)中TH2細(xì)胞的分化受到壓制。熒光定量PCR結(jié)果顯示,治療組的IL-4和TNF-α在結(jié)腸固有層的表達(dá)水平下降。結(jié)腸組織切片顯示治療組的腸絨毛水腫和炎癥細(xì)胞浸潤減輕,同時(shí)杯狀細(xì)胞的增生減低。(4)菌群分析結(jié)果表明,間充質(zhì)干細(xì)胞處理組小鼠腸道菌群穩(wěn)態(tài)較實(shí)驗(yàn)組和培養(yǎng)基對照組有一定的恢復(fù),其中,擬桿菌門明顯增多,變形菌門顯著下降。結(jié)論:間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用改善了食物過敏小鼠的臨床癥狀,其免疫抑制功能一定程度上抑制了小鼠體內(nèi)過敏反應(yīng)的發(fā)生,并且對小鼠腸道菌群有較好的恢復(fù)效應(yīng)。
【圖文】：

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對 OVA 實(shí)驗(yàn)性食物過敏的影響療等方面都有廣泛的應(yīng)用前景，甚至已經(jīng)取得成就[13, 14]。另外，在獲得性免疫和固有免疫方面，，間充質(zhì)干細(xì)胞也具有較強(qiáng)的免疫抑制作用[15, 16]，主要表現(xiàn)在對參與獲得性免疫的 T 細(xì)胞和 B 細(xì)胞以及參與固有免疫的 DC 和 NK 具有免疫抑制作用[17]。

MSCs與T細(xì)胞的相互作用
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R593.1

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8 熊q

本文編號：2600472