【摘要】：人體蛋白一旦發(fā)生淀粉樣變性,容易誘發(fā)多種神經(jīng)退行性疾病,如阿茲海默病、帕金森病、瘋牛病、家族性血管淀粉樣變性病、溶菌酶淀粉樣變性病等等。所謂淀粉樣變性主要是指蛋白質(zhì)出現(xiàn)錯(cuò)誤折疊或者部分降解,最終形成了不溶于血漿的淀粉樣纖維。它們能對(duì)人體泌尿、神經(jīng)、心血管等系統(tǒng)造成損害,引發(fā)多種疾病。也有研究表明,與疾病不相關(guān)的蛋白質(zhì)如胰島素,在一定的條件下也能轉(zhuǎn)化成淀粉樣纖維�？梢�(jiàn),淀粉樣纖維化是所有蛋白質(zhì)的共性。蛋白質(zhì)的淀粉樣纖維化過(guò)程是一個(gè)成核依賴過(guò)程。在這一過(guò)程中,蛋白單體首先組合成具有部分折疊結(jié)構(gòu)的中間體,再轉(zhuǎn)化為成核寡聚體。成核寡聚體進(jìn)一步生長(zhǎng)成為原纖維,原纖維通過(guò)彼此間相互聚集最終形成大分子的成熟纖維。本文以牛胰島素(Bovine Insulin,簡(jiǎn)稱BI)和雞蛋清溶菌酶(Lysozyme,簡(jiǎn)稱LYS)為體外研究模型,探索酚類(lèi)物質(zhì)及纖維種子在蛋白質(zhì)淀粉樣纖維化過(guò)程中產(chǎn)生的影響,以及它們的作用機(jī)理。主要過(guò)程包括：從酚類(lèi)物質(zhì)中篩選抑制劑；從是否形成共價(jià)鍵,是否轉(zhuǎn)化為醌式結(jié)構(gòu)的角度探究抑制劑的作用機(jī)理；研究纖維種子對(duì)淀粉樣纖維化過(guò)程的影響；分析纖維種子促進(jìn)作用的原理；探究不同抑制劑存在下纖維種子能否發(fā)揮促進(jìn)作用。主要實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果：1.牛胰島素、溶菌酶淀粉樣生長(zhǎng)檢測(cè)采用ThT(硫黃素T,Thioflavine T)熒光分析、ANS(8-苯胺基-1-萘磺酸,8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid)熒光分析、透射電子顯微鏡(TEM)技術(shù)檢測(cè)牛胰島素和溶菌酶在淀粉樣纖維化進(jìn)程中熒光強(qiáng)度和形態(tài)的改變。ThT能與蛋白中的p-折疊特異性結(jié)合,反映蛋白質(zhì)淀粉樣纖維化過(guò)程中p-折疊結(jié)構(gòu)的變化情況。ANS能夠與蛋白質(zhì)疏水區(qū)域進(jìn)行特異性結(jié)合,反映出纖維化過(guò)程中疏水區(qū)的暴露情況。結(jié)果表明,牛胰島素和溶菌酶的纖維化過(guò)程中都伴隨著p-折疊結(jié)構(gòu)的不斷增加和疏水區(qū)的逐漸暴露,其ThT生長(zhǎng)曲線均呈“S”型外觀,經(jīng)歷成核、生長(zhǎng)、成熟三個(gè)動(dòng)力學(xué)階段。在透射電鏡下孵育3天的牛胰島素外形呈球形小顆粒狀,孵育4天的牛胰島素呈現(xiàn)出稀疏、有分支的短鏈,孵育7天的牛胰島素和孵育12天的溶菌酶均為外觀粗壯、密集、無(wú)分支的直徑約5到35nm的長(zhǎng)鏈。2.EGCG對(duì)蛋白質(zhì)纖維化過(guò)程和成熟纖維的影響及機(jī)理探究通過(guò)ThT熒光分析篩選出同濃度的四種茶多酚中EGCG(表沒(méi)食子兒茶精-3-五倍子酸,Epigallocatechin Gallate)對(duì)蛋白質(zhì)的淀粉樣纖維化過(guò)程的抑制作用最強(qiáng),同時(shí)EGCG還對(duì)成熟的淀粉樣纖維有破壞作用。通過(guò)MALDI-TOF質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)被EGCG作用的樣品分子離子峰的質(zhì)荷比大于純牛胰島素,其差值剛好為EGCG的相對(duì)分子質(zhì)量減去一個(gè)氫原子的相對(duì)原子質(zhì)量。表明EGCG與牛胰島素發(fā)生了共價(jià)結(jié)合。將EGCG修飾后的蛋白進(jìn)行電泳、電轉(zhuǎn)分析,并配合巰基試劑DTT(二硫蘇糖醇,Dithiothreitol)、NEM(N-乙基順丁烯二酰亞胺,N-Ethylmaleimide)的運(yùn)用,判斷修飾在蛋白上的EGCG的形態(tài)及作用位點(diǎn)。結(jié)果表明EGCG是以蛋白上的巰基為作用位點(diǎn)對(duì)蛋白進(jìn)行修飾,同時(shí)EGCG自身轉(zhuǎn)化為了醌式結(jié)構(gòu)。3.常見(jiàn)酚類(lèi)物質(zhì)和對(duì)苯醌對(duì)蛋白質(zhì)纖維化過(guò)程的影響及機(jī)理探究采用ThT熒光分析、ANS熒光分析確定了鄰苯二酚、對(duì)苯二酚、對(duì)苯醌對(duì)蛋白質(zhì)淀粉樣纖維化過(guò)程能起到抑制作用。通過(guò)電轉(zhuǎn)分析發(fā)現(xiàn)鄰苯二酚、對(duì)苯二酚、對(duì)苯醌在堿性條件下能被NBT染成紫色,說(shuō)明鄰苯二酚和對(duì)苯二酚都已轉(zhuǎn)換為了相應(yīng)的醌類(lèi)物質(zhì)。四種常見(jiàn)的酚類(lèi)物質(zhì)中只有鄰苯二酚和對(duì)苯二酚因其特殊結(jié)構(gòu)能夠進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為鄰苯醌和對(duì)苯醌。而多酚類(lèi)物質(zhì)只有轉(zhuǎn)化成了醌類(lèi)物質(zhì)才能對(duì)蛋白質(zhì)的淀粉樣纖維化過(guò)程產(chǎn)生抑制。4.纖維種子對(duì)蛋白質(zhì)纖維化過(guò)程的影響把孵育成熟的淀粉樣纖維,在37℃的條件下進(jìn)行超聲,使纖維被徹底打碎,打碎后的纖維即可作為纖維種子加入其他樣品中進(jìn)行孵育。實(shí)驗(yàn)證明,纖維種子類(lèi)似于纖維化過(guò)程中的原纖維狀態(tài),其余蛋白質(zhì)可迅速在原纖維的基礎(chǔ)上聚集、生長(zhǎng),在極短的時(shí)間內(nèi),長(zhǎng)成成熟的纖維。把纖維化中、后期的蛋白樣品在37℃的條件下進(jìn)行超聲破碎,加入未孵育的蛋白中,仍然可以起到纖維種子的作用,加速蛋白質(zhì)的淀粉樣纖維化。不過(guò)纖維種子對(duì)蛋白質(zhì)纖維化的促進(jìn)能力與纖維種子自身的纖維化程度有關(guān)。纖維種子的纖維化程度越高,促進(jìn)作用越明顯。5.纖維種子和EGCG對(duì)蛋白質(zhì)纖維化過(guò)程的影響在牛胰島素中同時(shí)加入EGCG和纖維種子進(jìn)行孵育,通過(guò)ThT熒光分析發(fā)現(xiàn),在0-2天時(shí),同時(shí)加入EGCG和纖維種子的樣品熒光強(qiáng)度高于純牛胰島素樣品和只加入EGCG的樣品,但明顯小于只加入纖維種子的樣品。從第3天開(kāi)始,同時(shí)加入EGCG和纖維種子的樣品熒光強(qiáng)度逐漸降低,在第7天時(shí)和只加入EGCG的樣品熒光強(qiáng)度幾乎相同。通過(guò)透射電子顯微鏡分析發(fā)現(xiàn)纖維種子和EGCG共存的樣品在第7天時(shí)牛胰島素并未形成完整的纖維,仍為稀疏的短鏈,不過(guò)比只加入EGCG的樣品形成的纖維稍粗壯一些。故在纖維生長(zhǎng)的前期纖維種子和EGCG共同發(fā)揮了作用,纖維生長(zhǎng)的中后期主要是EGCG發(fā)揮其抑制作用。由于EGCG對(duì)蛋白的破壞作用是不可逆的,在EGCG存在的條件下即使加入纖維種子,最終也難以形成成熟的纖維。6.PEG對(duì)蛋白質(zhì)纖維化過(guò)程的影響PEG(聚乙二醇,Polyethylene Glycol)在溶液中能形成一種擁擠的環(huán)境,其濃度越大,對(duì)蛋白起到的分散作用就越明顯。蛋白間的相互聚集受到阻礙而難以形成纖維,故PEG對(duì)蛋白質(zhì)纖維化過(guò)程能起到一定的抑制作用。PEG作用后的樣品在任意時(shí)刻加入纖維種子,ThT熒光強(qiáng)度立刻增強(qiáng)。這是由于PEG只能把蛋白質(zhì)的纖維化抑制在原纖維階段,一旦加入纖維種子,蛋白就能在纖維種子的表面聚集、生長(zhǎng),迅速長(zhǎng)成成熟的纖維。結(jié)論：綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,牛胰島素和溶菌酶在一定的條件下均能形成淀粉樣纖維,其生長(zhǎng)曲線均呈“S”形。EGCG、鄰苯二酚和對(duì)苯二酚能抑制蛋白質(zhì)淀粉樣纖維化過(guò)程,破壞成熟的淀粉樣纖維,其機(jī)理都是酚類(lèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的醌式結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)的巰基發(fā)生了共價(jià)結(jié)合。纖維種子的存在能大大加速蛋白質(zhì)淀粉樣纖維化進(jìn)程。當(dāng)纖維種子與EGCG同時(shí)存在時(shí),纖維生長(zhǎng)的前期EGCG和纖維種子共同發(fā)揮作用,纖維生長(zhǎng)的中后期,則主要為EGCG發(fā)揮其抑制作用。PEG能在體系中營(yíng)造一種擁擠的環(huán)境,將蛋白的濃度分散,使蛋白與蛋白間無(wú)法聚集。然而PEG只能把蛋白質(zhì)的淀粉樣纖維化抑制在其原纖維的階段,在含PEG的體系中一旦加入纖維種子,蛋白就能在纖維種子的表面聚集、生長(zhǎng),迅速長(zhǎng)成成熟的纖維。
【學(xué)位授予單位】：陜西師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R597.2

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2514891