本文選題：間充質(zhì)干細(xì)胞　切入點(diǎn)：人類白細(xì)胞抗原G　出處：《南京大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：背景:系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一種累及多系統(tǒng)的自身免疫性疾病,主要表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞過度活化、自身抗體產(chǎn)生、免疫復(fù)合物沉積、炎性細(xì)胞因子增多等。近年來研究顯示,狼瘡患者體內(nèi)Treg細(xì)胞數(shù)目和功能都存在異常,在狼瘡的發(fā)病中扮演重要角色。人類白細(xì)胞抗原G(Human leukocyte antigen-G,HLA-G)具有較強(qiáng)的免疫抑制功能,可以抑制T細(xì)胞增殖和上調(diào)Treg細(xì)胞,包括膜結(jié)合型HLA-G(mHLA-G)及可溶性HLA-G(sHLA-G)兩種分子表達(dá)形式。sHLA-G是間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)分泌的一個關(guān)鍵的調(diào)控因子。MSCs具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)功能,治療難治性SLE患者取得了較好的療效,但機(jī)制尚不清楚。目的:檢測SLE血清sHLA-G的變化,分析sHLA-G水平和SLE病情活動指標(biāo)的相關(guān)性;探討MSCs移植治療狼瘡鼠和SLE患者的療效及機(jī)制;闡明MSCs通過sHLA-G上調(diào)Treg細(xì)胞治療SLE的機(jī)制。方法:1)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測68例SLE患者與32例健康對照者血清中sHLA-G的水平,分析SLE患者sHLA-G水平與SLEDAI評分、病程時間、血小板、肝功能、腎功能、血清補(bǔ)體C3、C4、血清抗dsDNA抗體、血沉、C反應(yīng)蛋白、24小時尿蛋白等相關(guān)性;采用密度梯度離心法(Ficoll法)分離15例SLE患者和15例健康對照者外周血單個核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMC),流式細(xì)胞術(shù)檢測 CD4+ILT2+、CD8+ILT2+、CD19+ILT2+和 Treg細(xì)胞百分率。2)用小分子干擾 RNA(SmallinterferingRNA,siRNA)干擾 MSC 表達(dá)的 sHLA-G,然后將24周齡雌性B6.MRL-Faslsr小鼠隨機(jī)分為MSCs治療組、HLA-G siRNA MSCs治療組和PBS組,并設(shè)同樣周齡的雌性C57BL/6小鼠為對照組,分別從尾靜脈注射1×106個細(xì)胞或等體積PBS。6周后處理小鼠。檢測小鼠脾臟指數(shù)、24小時尿蛋白、淋巴細(xì)胞亞群,分析腎臟病理。10例難治性SLE患者進(jìn)行人臍帶 MSCs(Umbilical Cord-derived MSCs,UC-MSCs)移植,按 106 個/kg 體重輸注細(xì)胞。移植前及移植后24小時分別抽取全血,分離血清,ELISA檢測移植前后sHLA-G和TGF-β1變化,流式檢測Treg細(xì)胞和其表面PD-1、CTLA-4分子水平以及CD4+ILT2+、CD8+ILT2+細(xì)胞和CD19+ILT2+細(xì)胞百分率。3)分離SLE患者及健康對照組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bonemarrow-derived MSCs,BM-MSCs),ELISA及PCR檢測SLE患者及健康對照者BM-MSCs的sHLA-G表達(dá)。將SLE患者PBMC與UC-MSCs不同比例下共培養(yǎng)3天,加或不加HLA-G中和抗體,流式檢測CD4+CD25+Foxp3+ T細(xì)胞百分率和T淋巴細(xì)胞增殖變化。磁珠分選CD4+ T和CD4+CD25-T細(xì)胞,與MSCs共培養(yǎng)3天。IFNy刺激MSCs 48小時后PCR檢測HLA-G mRNA表達(dá)。誘導(dǎo)SLE患者巨噬細(xì)胞,與MSCs共培養(yǎng)48小時,PCR檢測HLA-G mRNA表達(dá)。結(jié)果:狼瘡性腎炎患者血清sHLA-G水平(19.6±10.9ng/ml)較無腎臟累及的SLE患者(25.3±8.8ng/ml)顯著降低;活動性狼瘡患者(SLEDAI4)的血清sHLA-G水平與SLEDAI評分呈負(fù)相關(guān);此外,SLE患者血清sHLA-G水平與疾病病程、血肌酐、尿素氮、尿酸和24小時尿蛋白呈負(fù)相關(guān),與血小板呈正相關(guān)。SLE患者CD4+ T細(xì)胞和CD19+ B細(xì)胞上sHLA-G受體ILT2表達(dá)及Treg細(xì)胞百分率顯著下降,且CD4+ILT2+T細(xì)胞百分率與Treg細(xì)胞百分率成正相關(guān)。在小鼠中,MSCs治療組脾臟指數(shù)、24小時尿蛋白、腎臟病理顯著改善,但HLA-G siRNA MSCs治療組與MSCs治療組療效基本相當(dāng)。兩個細(xì)胞治療組均可顯著上調(diào)Treg細(xì)胞、Breg細(xì)胞和巨噬細(xì)胞百分率,下調(diào)Th17、Tfh細(xì)胞百分率,HLA-GsiRNA MSCs治療組下調(diào)漿細(xì)胞能力稍弱。SLE患者M(jìn)SCs移植治療后血清sHLA-G水平顯著升高,Treg水平及其表面PD-1、CTLA-4水平顯著升高,CD4+ILT2+細(xì)胞百分率也顯著升高。SLE患者BM-MSCs表達(dá)sHLA-G水平較健康對照組表達(dá)水平下降。MSCs體外可以濃度依賴性的上調(diào)Treg細(xì)胞百分率,加入HLA-G中和抗體后Treg細(xì)胞百分率顯著降低。MSCs可以部分通過sHLA-G抑制CD4+T淋巴細(xì)胞增殖。MSCs可以上調(diào)CD4+T細(xì)胞中的Treg細(xì)胞百分率,但不能誘導(dǎo)CD4+CD25-T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Treg細(xì)胞。IFNy可以上調(diào)MSCs表達(dá)的HLA-G mRNA水平。MSCs不能上調(diào)巨噬細(xì)胞表達(dá)的HLA-G mRNA水平。結(jié)論:SLE患者體內(nèi)sHLA-G及其受體ILT2表達(dá)異常,可能參與了系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病。MSCs移植治療SLE患者可上調(diào)sHLA-G和Treg細(xì)胞,提示MSCs可能通過調(diào)控sHLA-G上調(diào)Treg細(xì)胞治療狼瘡患者,但在小鼠中可能不通過調(diào)控sHLA-G發(fā)揮作用。
[Abstract]:BACKGROUND : Systemic lupus erythematosus ( SLE ) is a kind of autoimmune disease involving multiple systemic lupus erythematosus ( SLE ) . The levels of serum sHLA - G and TGF - 尾1 were detected by ELISA and PCR . The levels of serum sHLA - G and CD4 + CD25 - T cells were detected by ELISA and PCR . The levels of serum sHLA - G and CD4 + CD25 - T cells were detected by ELISA and PCR . Results : The serum sHLA - G levels of SLE patients were negatively correlated with the SLEDAI score . The expression of sHLA - G receptor ILT2 and the percentage of CD4 + ILT2 + cells in SLE patients were significantly higher than those in healthy controls .

【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R593.241

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本文編號：1684236