本文選題：瓊脂磁珠　切入點：消減SELEX　出處：《西北師范大學》2016年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：人類免疫缺陷病毒是艾滋病的病因。到目前為止,還沒有安全有效的治療辦法,以預防為主,普及HIV抗原抗體及病毒的檢測,盡可能早的發(fā)現感染者,早期干預,防止傳播。其中,HIV-P24抗原是HIV的核心蛋白,在病毒的包裝及成熟過程中起非常重要的作用。人體初次感染HIV,最早在患者血清中出現HIV抗原,2~3周可進行P24抗原的檢測。HIV-P24抗原是能從血清中最早檢測出的免疫標志物,HIV-P24蛋白早期準確檢測有利于早期診斷,可以縮短“窗口期”,同時P24檢測可預測病程,是跟蹤HIV進程上的有效手段。因此,建立一種快速準確檢測P24抗原的方法是很有必要的。適配體是人工體外篩選得到的一段寡核苷酸片段,由于其特殊的二級結構及三級結構,能與各種物質結合,如:抗原、抗體、病毒、金屬離子等。他們之間的結合類似于抗原抗體的結合,因此,核酸適配體有“化學抗體”之稱,但它有一些優(yōu)于抗體的特性:高的親合力和強的特異性;易制備及化學修飾;靶標范圍廣泛;分子小及無免疫原性。因此成功篩選出HIV-P24抗原特異性的適配體,有望建立一種基于該適配體的快速、準確、高效檢測HIV-P24抗原的方法,可縮短檢測的窗口期,為艾滋病的早期快速準確診斷奠定基礎。以羧基化瓊脂磁珠為靶標結合介質,HIV-P24抗原為靶標分子,用消減SELEX技術篩選HIV-P24抗原的特異性寡核苷酸適配體;后期又將篩選富集的次級文庫進行大腸桿菌DH5α轉化,并挑取陽性克隆進行交錯PCR檢測及序列測定。在整個HIV-P24抗原特異性寡核苷酸適配體篩選過程中對實驗中磁珠投入量、洗滌試劑及次數、結合時間、非靶標分子的替換等因素進行調整,最終確立了一套較為完整的高效篩選此類適配體的方案。利用消減SELEX技術,經過七輪的篩選,成功篩選獲得了HIV-P24抗原的特異性寡核苷酸適配體。將篩選得到的適配體轉化及克隆,挑取克隆團,通過交錯PCR技術鑒定陽性克隆,并對其特異性進行鑒定,最終得到了5個與HIV-P24抗原有較強特異性的克隆,獲得了測序結果。消減SELEX技術篩選到的HIV-P24抗原特異性寡核苷酸適配體,具有強的特異性,有望建立一種基于HIV-P24抗原特異性寡核苷酸適配體的快速、高效、準確檢測HIV-P24抗原的方法,可縮短檢測的窗口期,為艾滋病的早期快速準確診斷奠定基礎。
[Abstract]:The human immunodeficiency virus (HIV) is the cause of AIDS. So far, there is no safe and effective treatment that focuses on prevention, popularizes the detection of HIV antigens, antibodies and viruses, detects people infected as early as possible, and early intervention. Prevent transmission. HIV P24 antigen is the core protein of HIV. In the packaging and maturation of the virus plays a very important role. Human first infection of HIV, the earliest HIV antigen can be detected in the patient's serum for 3 weeks to detect P24 antigen. HIV-P24 antigen can be the first detected from the serum of the immune label. Early and accurate detection of HIV P24 protein is helpful for early diagnosis. "window period" can be shortened, and P24 detection can predict the course of disease, which is an effective means to track the HIV process. It is necessary to establish a rapid and accurate method for the detection of P24 antigen. Aptamer is a fragment of oligonucleotide obtained by artificial screening in vitro. Because of its special secondary and tertiary structures, aptamer can bind to various substances, such as antigen. Antibodies, viruses, metal ions, etc. Their binding is similar to the binding of antigens and antibodies, so nucleic acid aptamers are known as "chemical antibodies", but it has some advantages over antibodies: high affinity and strong specificity; Easy preparation and chemical modification; wide range of targets; small molecules and no immunogenicity. Therefore, the successful screening of HIV-P24 antigen specific aptamer is expected to establish a rapid, accurate and efficient method for detection of HIV-P24 antigen based on the aptamer. It can shorten the window period of detection and lay a foundation for the early rapid and accurate diagnosis of AIDS. The specific oligonucleotide aptamer of HIV-P24 antigen was screened by subtractive SELEX with carboxylated Agar beads as target binding medium and HIV-1 P24 antigen as target molecule. In the later stage, the enriched secondary library was transformed into Escherichia coli DH5 偽, and the positive clones were selected for interleaving PCR detection and sequencing. The amount of magnetic beads was injected into the whole HIV-P24 antigen specific oligonucleotide aptamer screening process. The washing reagents and times, combined with time, substitution of non-target molecules and other factors were adjusted to establish a relatively complete and efficient program for screening these aptamers. By using subtractive SELEX technology, seven rounds of screening were carried out. The specific oligonucleotide aptamer of HIV-P24 antigen was successfully screened. The selected aptamer was transformed and cloned. The positive clones were identified by interleaving PCR technique and their specificity was identified. Finally, five clones with strong specificity to HIV-P24 antigen were obtained, and sequencing results were obtained. HIV-P24 antigen-specific oligonucleotide aptamers screened by subtractive SELEX technique had strong specificity. It is expected that a rapid, efficient and accurate method for detecting HIV-P24 antigen based on HIV-P24 antigen-specific oligonucleotide aptamers can shorten the window period of detection and lay a foundation for the early rapid and accurate diagnosis of AIDS.
【學位授予單位】：西北師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R512.91

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