本文關(guān)鍵詞：Indian Hedgehog信號通路相關(guān)因子在氟中毒大鼠軟骨組織及軟骨細(xì)胞中的表達(dá)及其意義

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【摘要】：目的通過檢測慢性氟中毒大鼠軟骨組織及其軟骨細(xì)胞中Ihh、Smo、PTHrp蛋白與mRNA表達(dá)水平變化,探討Indian hedgehog(Ihh)信號通路在慢性氟中毒體內(nèi)及體外的作用與機(jī)制。方法1、建立動物染氟模型,SD大鼠36只,按體重隨機(jī)分為3組,每組12只,對照組:氟離子濃度1 mg/L、低氟中毒組:NaF濃度5 mg/L、高氟中毒組:NaF濃度50 mg/L。飼養(yǎng)6個月后應(yīng)用氟離子選擇電極法測定尿氟,股骨骨氟,蘇木素-伊紅(Hematoxylin and Eosin,HE)染色后光鏡下觀察軟骨組織形態(tài)學(xué)病理改變;免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry,IHC)PV-6001法檢測大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織中Ihh、Smo、PTHrp蛋白以及凋亡調(diào)控蛋白Bcl-2、Bax和增殖調(diào)控蛋白Cyclin D1、PCNA表達(dá)情況。2、建立細(xì)胞染氟模型,原代培養(yǎng)乳鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞,傳第3代后按染氟濃度不同分為0(對照)、5、10、20、40 mg/L組,噻唑藍(lán)(MTT)、流式細(xì)胞術(shù)分別檢測各組細(xì)胞增殖、凋亡的變化。蛋白印跡(Western Blot)和逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測各組染氟48 h后Ihh信號通路中Ihh、Smo、PTHrp的蛋白及其mRNA表達(dá)含量。結(jié)果1、慢性氟中毒大鼠模型建立成功。與對照組(1.73±0.07、1.95±0.06)相比,低、高氟組大鼠尿氟、骨氟含量(2.34±0.21、4.33±0.46;98.81±9.03、131.52±9.14)逐漸升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);2、光鏡觀察發(fā)現(xiàn),隨著染氟劑量增加,低、高氟組較對照組關(guān)節(jié)軟骨組織明顯變薄且排列紊亂,部分細(xì)胞有變性。3、大鼠軟骨組織免疫組化與Western blot結(jié)果顯示,與對照組相比,低、高氟組Ihh、Smo、PTHrp、Bax蛋白表達(dá)逐漸升高,而低、高氟組Bcl-2、Cyclin D1、PCNA蛋白表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。4、成功獲得了性狀和表型一致的大鼠軟骨細(xì)胞,MTT結(jié)果顯示,與對照組比較,各時間段5 mg/L染氟組細(xì)胞增殖率[1.10±0.08、1.13±0.08、1.15±0.08比1.17±0.07、1.20±0.06、1.16±0.08]明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),40 mg/L染氟組細(xì)胞48h、72h增殖活性[0.72±0.11、0.68±0.04]則顯著降低(P0.05)。流式檢測結(jié)果表明,與對照組相比較,24、48、72 h時40 mg/L染氟組軟骨細(xì)胞凋亡率逐漸增高[(19.87±3.03)%、(25.30±1.28)%、(45.73±4.63)%]差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。5、與對照組相比,培養(yǎng)48 h后Ihh、Smo、PTHrp的蛋白及其mRNA表達(dá)在染氟各組(Ihh蛋白:0.77±0.08比0.98±0.07、1.23±0.06、1.37±0.07、1.34±0.07;PTHrp蛋白:0.68±0.04比0.89±0.05、0.83±0.05、1.29±0.05、1.16±0.08;Smo蛋白:0.37±0.01比0.64±0.06、0.67±0.03、0.96±0.06、0.69±0.06,Ihh mRNA:0.77±0.05比0.98±0.05、1.09±0.05、1.27±0.03、1.46±0.06;PTHrp mRNA:0.67±0.07比0.97±0.05、1.07±0.08、1.37±0.05、1.45±0.05;Smo mRNA:0.45±0.03比0.63±0.04、0.71±0.05、0.81±0.01、1.00±0.02)均高于對照組(P0.05)。結(jié)論1、過量氟可導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨組織損傷;同時,低劑量的氟可促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖,而高劑量氟會導(dǎo)致軟骨細(xì)胞凋亡。2、過量氟可刺激軟骨組織及軟骨細(xì)胞中Ihh、Smo、PTHrp的蛋白及其mRNA表達(dá)升高,證明體內(nèi)及體外均存在Ihh信號通路表達(dá),并受氟劑量的增多而升高。提示氟上調(diào)軟骨中Ihh信號通路相關(guān)因子以及促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖與凋亡可能共同參與軟骨的損傷過程。
【學(xué)位授予單位】：貴州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R599.1

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