目的:研究生松素(pinocembrin,Pb)對高糖誘導的腎小管上皮細胞炎癥因子表達的影響,并探討其作用機制,為糖尿病腎病(diabetic nephropath,DN)的防治提供新思路。方法:(1)高糖最佳作用時間的篩選:體外培養(yǎng)的大鼠腎小管上皮細胞(NRK-52E),予以30 mmol/L葡萄糖干預不同時間(0小時、6小時、12小時、24小時、36小時、48小時、72小時),采用ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β的分泌水平;(2)生松素的抗炎作用及機制:將NRK-52E細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的低糖DMEM中,將細胞隨機分為正常對照(normal control,NC)組、甘露醇(m annitol,MA)組、高糖(high glucose,HG)組、HG+DMSO組、HG+Pb30組、HG+Pb60組(預試驗篩選出Pb的低劑量干預濃度為30 umol/L,高劑量干預濃度為60 umol/L)、HG+Val組:采用免疫熒光法檢測細胞內(nèi)p-P38MAPK表達水平,采用Western-blot檢測細胞內(nèi)P38MAPK、p-P38MAPK、NF-κB、p-NF-κB、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK水平,ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β分泌水平,采用qPCR法檢測細胞內(nèi)T NF-α、IL-6、IL-1β的mRNA水平。(3)P38MAPK激動劑茴香霉素(Aniso mycin,AM)逆轉Pb的抗炎作用,明確Pb的抗炎作用是否是依賴P38M APK通路:將NRK-52E細胞隨機分為NC組、HG組、HG+AM組、HG+Pb30組、HG+Pb30+AM組;采用Western-blot檢測細胞內(nèi)P38MAPK、pP38MAPK水平,采用ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β分泌水平。結果:1.高糖誘導細胞合成和分泌炎癥因子最佳作用時間篩選:隨著高糖干預時間的延長,細胞內(nèi)TNF-α、IL-6、IL-1β表達水平隨之升高,與0小時相比,TNF-α、IL-6在48小時達到高峰(P0.05),IL-1β在72小時達到高峰(P0.05),最終確定48小時為最終刺激時間。2.生松素抑制H G誘導的NRK-52E細胞合成和分泌炎癥因子:ELISA結果顯示,在蛋白質水平,與NC組相比,HG組IL-6、TNF-α、IL-1β水平明顯升高(P0.05);而HG+Pb30、HG+Pb60組IL-6、TNF-α、IL-1β水平均較HG組明顯降低(P0.05)。qPCR結果顯示,在轉錄水平,與NC組比較,HG組細胞內(nèi)IL-6、TNF-α、IL-1β的mRNA水平明顯升高(P0.05);而HG+Pb30、HG+Pb60組細胞內(nèi)IL-6、TNF-α、IL-1β的mRNA水平較HG組均明顯下降(P0.05)。3.生松素抑制HG誘導的NRK-52E細胞MAPK信號通路的激活:(1)在蛋白質水平,免疫熒光結果顯示,HG組的綠色熒光(p-P38M APK)較NC組明顯增強,而HG+Pb30、HG+Pb60組的綠色熒光均較HG組明顯減弱;Western blot結果顯示,與NC組相比,HG組p-P38MAPK/P38MAPK水平明顯升高(P0.05),而HG+Pb30、HG+Pb60組p-P38MA PK/P38MAPK水平均較HG組明顯降低(P0.05)。(2)Western blot結果顯示,與NC組相比,HG組p-JNK/JNK水平明顯升高(P0.05),而HG+Pb30、HG+Pb60組p-JNK/JNK較HG組表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。(3)Western blot結果顯示,與NC組相比,HG組p-ERK/ERK水平明顯升高(P0.05),而HG+Pb30、HG+Pb60組p-ERK/ERK較HG組表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。4.生松素抑制高糖誘導的NRK-52E細胞NF-κB激活:Western blot結果顯示,與NC組相比,H G組p-NF-κB/NF-κB水平明顯升高(P0.05),而HG+Pb30、HG+Pb60組p-NF-κB/NF-κB水平均較HG組明顯降低(P0.05)。5.AM逆轉生松素對高糖誘導的NRK-52E細胞P38MAPK表達的抑制作用:Western blot結果顯示,在蛋白質水平,與NC組相比,HG組、HG+AM組p-P38MAP K/P38MAPK水平明顯升高(P0.05),與HG組相比,HG+AM組p-P38MAPK/P38MAPK水平進一步升高(P0.05),HG+Pb30組p-P38MAPK/P38MAPK水平明顯降低(P0.05),而HG+Pb30+AM組細胞內(nèi)p-P38M APK/P38MAPK水平較HG組比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。6.AM逆轉生松素對高糖誘導的NRK-52E細胞炎癥因子的抑制作用:ELISA結果顯示,在蛋白質水平,與NC相比,HG組、HG+AM組IL-6、TNF-α、IL-1β水平明顯升高(P0.05),與HG組相比,HG+AM組IL-6、TNF-α、IL-1β水平進一步升高(P0.05),HG+Pb30組IL-6、TNF-α、IL-1β水平明顯降低(P0.05),而HG+Pb30+AM組細胞培養(yǎng)上清液中IL-6、TNF-α、IL-1β水平較HG組比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論:1.Pb可抑制HG誘導的腎小管上皮細胞炎癥因子的表達。2.Pb通過抑制P38MA PK信號通路的激活而抑制HG誘導的腎小管上皮細胞炎癥因子的表達。
【學位單位】：西南醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R587.2;R692.9
【部分圖文】：

圖 1-1 ELISA 法檢測細胞培養(yǎng)上清液Figure 1-1 ELISA detected the level of IL-6、*代表與 0h 比較 P<0.05。Pb 對 HG 誘導的 NRK-52E 細胞合成ELISA 結果顯示，在蛋白質水平液中 IL-6、TNF-α、IL-1β 水平明顯b60、HG+Val 組細胞培養(yǎng)上清液中顯降低（P<0.05）（見表 2-1，圖 2與正常組比較，HG 組細胞內(nèi) IL-6、（P<0.05）； 而 HG+Pb30、HG+P

Table 2-1 ELISA detected the level of IL-6、TNF-α、IL-1β in the supernata組別 樣本數(shù) IL-6（pg/mL） TNF-α（pg/mL） IL-1β（pg/mL）NC 組 3 14.778±1.957 23.146±1.518 21.298±2.233MA 組 3 15.644±0.945 22.753±2.482 21.396±1.254HG 組 3 45.446±3.055* 62.415±3.455* 43.786±2.419*HG+DMSO 組 3 46.252±2.041* 62.608±1.953* 44.260±2.742*HG+Pb30 組 3 34.152±1.590# 43.483±2.975# 32.567±1.872#HG+Pb60 組 3 34.129±2.030# 42.195±2.991# 30.728±2.143#HG+val組 3 22.244±2.119# 34.899±4.297# 25.801±2.020#注：*代表與 NC 組比較 P<0.05，#代表與 HG 組比較 P<0.05。

qPCR檢測IL-6、TFigure2-2qPCRdetectedthem

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