【摘要】：目的:1.研究人臍帶間充質(zhì)干細胞(UC-MSC)對環(huán)磷酰胺(CTX)導致的大鼠肝、腎損傷的治療作用。2.探索在UC-MSC治療CTX導致的腎損傷中經(jīng)典Wnt/b-catenin信號通路所發(fā)揮的作用。方法:1.UC-MSC的分離、培養(yǎng)和鑒定從新鮮臍帶中分離并培養(yǎng)貼壁細胞至第4代,顯微鏡下觀察其形態(tài),流式細胞術鑒定其細胞表型,并鑒定其成骨、成脂、成軟骨等誘導分化能力。2.環(huán)磷酰胺導致大鼠肝、腎損傷模型的建立并鑒定將12只SD大鼠隨機分為Control組和CTX組,CTX組大鼠腹腔注射CTX(200mg/Kg),對照組以相同的方式注射等量PBS。24小時后處死,檢測以下指標確定造模是否成功。2.1檢測血清中生化指標改變外周血離心(3500g,20min)取上清,檢測血清中谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總膽紅素(TBIL)、血尿素氮(BUN)和肌酐(creatinine)的表達。2.2檢測肝、腎組織均漿中氧化應激損傷指標:應用超聲法將肝、腎組織制成10%的組織均漿,檢測其中丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、脂質(zhì)過氧化物(LPO)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽過氧化物(GSH-PX)的表達。2.3組織病理學檢查肝、腎組織切片,行HE染色,比較其病理學改變。3.UC-MSC對CTX導致的大鼠肝、腎損傷的治療作用的實驗研究將成年雄性SD大鼠隨機分成Control組、CTX組和CTX+UC-MSC組,將CTX+U-MSC組第1次尾靜脈注射UC-MSC記為實驗第1天(D1)。CTX+UC-MSC組D1、D4、D7、D10 尾靜脈注射 UC-MSC(2X10^6/只),CTX 組和 CTX+UC-MSC 組D3腹腔注射CTX(200mg/kg)。Control組在相同時間以相同方式注射生理鹽水。在D4、D7、D10、D13每組隨機選取6只大鼠處死。3.1用化學分析法檢測不同組血清中ALT、AST、ALP、TBIL、BUN和肌酐的變化。3.2用生化學方法檢測不同組肝、腎組織均漿中MDA、LPO、NO、T-SOD、GSH、GSH-PX 的表達。3.3檢測肝、腎組織中凋亡相關蛋白基因和VEGFA基因表達從肝、腎組織中提取RNA,并用Real time qPCR法檢測組織中凋亡相關蛋白基因(Bax和Bcl-2)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGFA)基因的表達。3.4病理學檢查肝、腎組織固定后切片,行HE染色和免疫組化染色(α-SMA和Ki-67染色)。4.Wnt/β-catenin信號通路在UC-MSC治療CTX導致的大鼠腎損傷中的作用提取腎組織蛋白,Western blot 法檢測蛋白中 Wnt3、β-catenin、Axin2、occludin、內(nèi)皮細胞生長因子受體1(VEGFR1)和平滑肌肌動蛋白α(α-SMA)的表達。結(jié)果1.UC-MSC的分離、培養(yǎng)和鑒定:臍帶中分離培養(yǎng)的細胞呈漩渦樣貼壁生長,流式細胞術示該細胞高表達CD44、CD73、CD90和CD105,低表達CD34和CD45,該細胞可向成骨、成脂、成軟骨細胞特定分化,符合UC-MSC的定義,提示該細胞為UC-MSC。2.CTX導致大鼠肝、腎損傷模型的建立2.1與Control組相比,CTX組血清中ALT、AST、ALP、TBIL表達升高(P0.05),說明肝功能受損;BUN和肌酐的表達均升高(P0.05),這說明腎功能受損。2.2肝、腎組織均漿中,CTX組SOD、GSH和GSH-PX的表達低于Control組(P0.05),MDA、LPO和NO表達高于Control組(P0.05),說明肝腎均受到CTX導致的氧化應激損傷。2.3組織病理學觀察,CTX誘導的肝臟組織肝索紊亂,肝細胞基質(zhì)疏松淡染,呈氣球樣變,部分細胞內(nèi)可見脂肪空泡,有的空泡較大將肝細胞核擠壓靠近肝細胞膜呈月牙狀,局部可見炎細胞浸潤。CTX誘導的腎臟組織可見腎小球壞死,炎細胞浸潤,出血,周圍腎小管水腫。3.UC-MSC對CTX導致的大鼠肝、腎損傷的治療作用3.1與CTX組相比,在任意時間點,UC-MSC處理后血清中ALT、AST、ALP、TBIL、BUN和肌酐的表達均下降(P0.05)。3.2肝、腎組織均漿中,在任意時間點,CTX+UC-MSC組SOD、GSH和GSH-PX的表達高于CTX組(P0.05),MDA、LPO和NO表達低于CTX組(P0.05)。3.3 Real-time qPCR檢測發(fā)現(xiàn),與Control組相比,大鼠注射CTX后,肝、腎組織內(nèi)Bax的mRNA表達上調(diào),Bcl-2的mRNA表達下調(diào)(P0.05)。尾靜脈注射UC-MSC后,Bax表達減少,Bcl-2表達增加(P0.05)。CTX+UC-MSC組肝、腎組織內(nèi)VEGFA的mRNA表達遠高于Control組和CTX組(P0.05)。3.4組織病理學改變:CTX誘導的肝臟組織肝索紊亂,肝細胞基質(zhì)疏松淡染,呈氣球樣變。局部可見炎細胞浸潤。部分細胞可見脂肪空泡使細胞核呈月牙狀。UC-MSC預處理的大鼠肝臟病變程度輕于CTX組。腹腔注射CTX后,CTX+UC-MSC組大鼠肝臟恢復速度快于CTX組。CTX誘導的腎臟組織可見腎小球壞死,炎細胞浸潤,出血,周圍腎小管水腫。UC-MSC預處理的大鼠腎臟病變程度低于CTX組,尾靜脈多次注射UC-MSC可加快腎損傷的恢復。3.5免疫組化:Control組未見α-SMA+細胞,CTX注射后,肝臟組織在D4可見散在α-SMA+細胞,D13時可見大量α-SMA+細胞,尾靜脈注射UC-MSC后,肝臟切片α-SMA+細胞在各個時間點的表達均低于CTX組。Control組切片發(fā)現(xiàn)Ki-67+細胞散在分布于血管內(nèi)壁,肝臟組織內(nèi)未發(fā)現(xiàn)Ki-67+細胞。CTX組肝臟切片在血管附近和肝臟組織內(nèi)可見散在少量Ki-67+細胞。UC-MSC處理后,Ki-67+細胞數(shù)量多于CTX組,多分布于肝臟組織內(nèi)和大血管周圍。大鼠腎臟組織中,Control組未見α-SMA+組織,CTX組在D10和D13腎小球內(nèi)可見α-SMA+的纖維化組織,CTX+UC-MSC組內(nèi)α-SMA+組織較CTX組少。在大鼠腎小管周圍,Control組可見少量Ki-67+細胞,CTX組和CTX+UC-MSC組Ki-67+細胞數(shù)量增多,且UC-MSC處理后Ki-67+細胞多于CTX組。4.腎臟組織中,與CTX組相比,CTX+UC-MSC組Wnt/β-catenin信號通路的關鍵蛋白Wnt3、β-catenin和Axin2蛋白表達上調(diào),連接蛋白occludin表達升高,VEGFR1表達增加,α-SMA+表達下降。結(jié)論:1.UC-MSC預處理可減輕CTX導致的大鼠肝、腎損傷,損傷后尾靜脈多次注射UC-MSC可加速損傷的修復;2.UC-MSC治療CTX導致的大鼠腎損傷可能是通過激活組織內(nèi)經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路實現(xiàn)的。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R575;R692
【圖文】：

圖１人臍帶間充質(zhì)千細胞鑒定。Ａ為ｈＵＣ－ＭＳＣ形態(tài)學表現(xiàn)；Ｂ為流氏細胞逡逑學鑒定ｈＵＣ－ＭＳＣ；邋Ｃ為堿性磷酸酶染色；Ｄ為甲苯胺藍染色；Ｅ為油紅０染色。逡逑

圖２邋ＣＴＸ正常大鼠與注射ＣＴＸ后大鼠大體改變及血清生化指標的比較。Ａ逡逑和Ｂ分別為正常大鼠和ＣＴＸ組大鼠；Ｃ為Ｃｏｎｔｒｏｌ組與ＣＴＸ組大鼠體重變化；逡逑Ｄ為兩組大鼠肝臟／體重比率的比較；Ｅ為兩組大鼠腎臟／體重比率的比較；Ｆ－Ｉ依逡逑血ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＡＬＰ、ＴＢＩＬ的變化；Ｋ和Ｊ分別表示兩組大逡逑

圖３正常大鼠與ＣＴＸ組大鼠肝腎組織臟內(nèi)氧化應激損傷指標的比較。Ａ－Ｆ逡逑表示Ｃｏｎｔｒｏｌ組與ＣＴＸ組大鼠肝臟組織均漿內(nèi)氧化應激損傷指標的比較，依次為逡逑ＭＤＡ、ＬＯＰ、ＮＯ、ＳＯＤ、ＧＳＨ邋和邋ＧＳＨ－ＰＸ邋的比較；Ｇ－Ｌ邋表示邋Ａ－Ｆ邋表示邋Ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑組與ＣＴＸ組大鼠腎臟組織均漿內(nèi)氧化應激損傷指標的比較，依次為ＭＤＡ、ＬＯＰ、逡逑

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 ;Human umbilical cord Wharton's Jelly-derived mesenchymal stem cells differentiation into nerve-like cells[J];Chinese Medical Journal;2005年23期

本文編號：2764744