發(fā)布時間：2020-07-09 16:00

【摘要】：糖基化修飾,是人體內(nèi)蛋白質(zhì)最普遍的修飾方式之一。N聯(lián)糖基化修飾普遍存在于細胞外蛋白,比如體液蛋白、分泌蛋白、細胞膜蛋白等。精漿是精子(細胞)生存的外部環(huán)境,主要由睪丸和附屬性腺分泌,富含體液蛋白和分泌蛋白,據(jù)此推測精漿中應該富含N聯(lián)糖基化修飾的蛋白質(zhì)。精漿樣本相對容易獲取,精漿中蛋白含量較血液和尿液更豐富,通過質(zhì)譜和其他檢測技術可以進行定性和定量檢測。這都提示精漿N聯(lián)糖基化蛋白質(zhì)有潛力作為男性生殖系統(tǒng)疾病的無創(chuàng)性診斷標記物,有助于疾病的早期篩查和輔助診斷。糖基化修飾對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能有重要影響,可以通過糖與碳水化合物相互作用,調(diào)控細胞粘附與識別,參與細胞間,細胞與細胞外基質(zhì)相互作用。精漿糖基化蛋白質(zhì)正是通過這些功能調(diào)控精子在女性生殖道的運輸以及與卵子的結(jié)合。已知有為數(shù)不多的精漿蛋白被鑒定為N聯(lián)糖基化蛋白,例如PSA、Glycodelin S、FN1、SEMG等,研究發(fā)現(xiàn)這些蛋白不同程度參與了男性生殖功能。雖然精漿中糖基化蛋白有非常重要的功能和臨床意義,但我們對人類精漿N聯(lián)糖基化蛋白質(zhì)整體構(gòu)成和功能的了解仍然有限,值得關注和開展研究。本項研究第一部分構(gòu)建了一個高度可信的人類精漿N聯(lián)糖基化修飾蛋白質(zhì)譜系。構(gòu)建糖基化蛋白質(zhì)譜系方法為運用凝集素富集N聯(lián)糖基化肽段,然后使用糖肽酶切割富集肽段結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜掃描。考慮到個體間糖基化蛋白質(zhì)可能存在差異,進行了5次生物學重復鑒定(標本均來源自正常生育人群且精液參數(shù)正常),結(jié)果表明正常人群精漿N-糖基化蛋白質(zhì)構(gòu)成大致相似。本次研究共鑒定到372個糖基化蛋白和720個糖基化位點。為了進一步研究精漿中糖蛋白的功能,利用ToppGene軟件進行GO與KEGG功能學分析。372個鑒定到的糖基化蛋白質(zhì)對應到365個Entrez基因。精漿糖基化蛋白主要富集在細胞外區(qū)域(138基因)、溶酶體(76個基因)、細胞膜(61個基因),其中43%(160個蛋白)是分泌蛋白,最顯著的生物進程與細胞粘附有關(涉及78個基因),功能分析提示精漿糖基化蛋白質(zhì)可能調(diào)控精液凝固與液化,精子運動與獲能,并參與精卵識別與融合。比較本研究與已發(fā)表男性生殖系統(tǒng)生物標志物發(fā)現(xiàn),我們鑒定到的糖基化蛋白質(zhì)有11個是附睪特異性,10個是睪丸特異性,4個是精囊特異性,3個是前列腺特異性,提示這些糖基化蛋白可以作為生殖系統(tǒng)和不育癥的診斷標記物。研究的第二部分著重觀察精漿糖基化蛋白質(zhì)和生化指標,精子參數(shù)對精子前向運動的影響。研究發(fā)現(xiàn)弱精組較正常組的精子濃度(64.6±33.8 VS88.4±44.1)×106/ml,正常形態(tài)率(9.4±5.3 VS 12.9±5.6)%明顯下降,有統(tǒng)計學意義,說明精子前向運動與精子濃度和形態(tài)密切相關。精漿果糖濃度與精子前向運動比例(r=0.21),精子總活力(r=0.25)均呈正相關,有統(tǒng)計學意義。我們挑選4個精漿糖基化蛋白質(zhì)(LTF,FN1,SEMG2,WFDC2)進行免疫印跡實驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)LTF和精子前向運動有相關性,精漿中LTF表達量在弱精組較正常組明顯下降,有統(tǒng)計學意義(P0.01)。LTF由精囊腺和前列腺分泌,提示附屬性腺分泌不足影響精子前向運動。第二部分研究結(jié)果表明精子本身質(zhì)量在精子前向運動發(fā)揮基本作用,這由睪丸生精功能決定的;而附屬性腺分泌的精漿蛋白如糖基化蛋白發(fā)揮重要調(diào)控功能。進一步的研究可以觀察體外添加LTF對精子運動的影響,探討精漿中LTF分泌的影響因素和調(diào)控精子運動的機制。
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R698.2
【圖文】：

20圖 1：人類精漿 N 聯(lián)糖基化蛋白質(zhì)組學的特征，及與其他已知糖蛋白的對比。（A）五次生物學重復鑒定的 N 聯(lián)糖基化蛋白質(zhì)覆蓋率；（B）五次生物學重復鑒定的 N 聯(lián)糖基化位點覆蓋率；（C）用 MotifX. WebLogo 3 衍生的 N 聯(lián)糖基化相對頻率圖及共有序列；（D）精漿糖基化蛋白質(zhì)譜中蛋白質(zhì)上分布的 N 聯(lián)糖基化位點數(shù)目。Rolland 等總結(jié)了既往的蛋白質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，總結(jié) 2545 種不同的人類精漿蛋白質(zhì)[40]。在這些蛋白質(zhì)中，我們的研究表明其中 263 個為糖基化蛋白質(zhì)（圖2A）。在我們的糖基化蛋白質(zhì)譜系，109 個糖基化蛋白質(zhì)是第一次被鑒定到，在以往的精漿蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)庫中沒有提及。糖基化位點的周圍序列（二端各6 個氨基酸）是糖基化修飾的調(diào)控序列，在 dbPTM 數(shù)據(jù)庫中，通常用這些調(diào)

我們的研究表明其中 263 個為糖基化蛋白質(zhì)（圖2A）。在我們的糖基化蛋白質(zhì)譜系，109 個糖基化蛋白質(zhì)是第一次被鑒定到，在以往的精漿蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)庫中沒有提及。糖基化位點的周圍序列（二端各6 個氨基酸）是糖基化修飾的調(diào)控序列，在 dbPTM 數(shù)據(jù)庫中，通常用這些調(diào)

釗湎嗷プ饔霉叵怠?6 個基因通過 147 個相互作用關聯(lián)(圖3A)。關聯(lián)最多的基因是 FN1（22 個相互關聯(lián)基因），其次是 TGFB1（19 個相互關聯(lián)基因），其他還有比如 CLU，SERPINA1，TIMP1 也都與其他糖基化蛋白質(zhì)有廣泛的相互作用關系。

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本文編號：2747677