【摘要】：腎臟缺血再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury)是腎移植過程中不可避免的病理生理現(xiàn)象,貫穿于器官獲取、器官運(yùn)輸、移植手術(shù)以及術(shù)后恢復(fù)全過程。腎臟缺血再灌注損傷是腎臟中多種細(xì)胞共同參與的一類無菌性炎癥反應(yīng),以腎小管上皮細(xì)胞損傷修復(fù)或凋亡壞死為顯著性特征,臨床上可表現(xiàn)為移植腎功能延遲恢復(fù)或急慢性排斥。腎小管上皮細(xì)胞對缺血缺氧環(huán)境較為敏感,且又是腎臟結(jié)構(gòu)組成中的主要細(xì)胞單位。研究其在缺血再灌注損傷中損傷和修復(fù)過程,以及此過程中關(guān)鍵基因的表達(dá)調(diào)控和機(jī)制,將有可能是解決腎臟缺血再灌注損傷的有效途徑。蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1屬于酪氨酸磷酸酶家族中的重要成員,主要負(fù)責(zé)負(fù)向調(diào)控造血細(xì)胞的酪氨酸磷酸化信號通路。磷酸化和去磷酸化反應(yīng)是機(jī)體對外界環(huán)境刺激的重要表現(xiàn)形式和維持自身穩(wěn)態(tài)的必要方式。當(dāng)機(jī)體受到環(huán)境刺激壓力時,激酶發(fā)生級聯(lián)激活,抗壓基因表達(dá)上調(diào)來應(yīng)對環(huán)境壓力;磷酸酶則使底物磷酸根基團(tuán)發(fā)生水解反應(yīng)以去除,使之回到靜息狀態(tài),最終使得機(jī)體維持穩(wěn)態(tài)。SHP-1的功能首次在SHP-1基因缺陷小鼠的異常表型中得到闡釋,即SHP-1缺失后表現(xiàn)為炎癥過度激活不受控制,最終小鼠死于自身免疫反應(yīng)。隨后SHP-1被證明與多種免疫細(xì)胞的功能狀態(tài)均有關(guān),調(diào)控多種類型的免疫細(xì)胞信號傳導(dǎo)。然而,SHP-1在非造血細(xì)胞中的作用尚不明確。為了探究SHP-1在腎臟缺血再灌注損傷中的作用與機(jī)制研究,本研究使用SHP-1基因突變?nèi)笔托∈?構(gòu)建腎臟缺血再灌注損傷模型。對比同窩野生型小鼠,我們發(fā)現(xiàn)SHP-1缺失后,腎小管上皮細(xì)胞凋亡和壞死顯著增多。這提示SHP-1的作用機(jī)制可能與凋亡信號通路相關(guān),且有可能是一種保護(hù)作用。在進(jìn)一步檢測其他凋亡指標(biāo)后,更加明確了SHP-1缺失使得小鼠面臨更為嚴(yán)重的腎臟缺血再灌注損傷,即確認(rèn)了SHP-1可能通過調(diào)控凋亡信號通路,對腎臟缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用。然而,SHP-1具體是作用于何種細(xì)胞而發(fā)揮功能尚未可知。SHP-1既有可能是抑制巨噬細(xì)胞為代表的免疫細(xì)胞的活化,降低炎癥反應(yīng)從而減輕缺血再灌注損傷;也有可能是直接作用于腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞,如腎小管上皮細(xì)胞,抑制其凋亡信號通路的激活。據(jù)此,我們設(shè)計了巨噬細(xì)胞清除實(shí)驗(yàn)來評估巨噬細(xì)胞在其中發(fā)揮的功能。通過對野生型和SHP-1缺陷小鼠注射氯膦酸二鈉脂質(zhì)體(clodronate liposome)和對照試劑(PBS liposome),我們發(fā)現(xiàn)清除巨噬細(xì)胞后,腎損傷都有所減輕,即明確了巨噬細(xì)胞在腎缺血再灌注損傷中的促進(jìn)炎癥發(fā)生發(fā)展的作用。但通過進(jìn)一步深入比較清除巨噬細(xì)胞帶來的保護(hù)作用,發(fā)現(xiàn)這種保護(hù)作用在兩種基因型小鼠中相當(dāng),即清除巨噬細(xì)胞帶來的保護(hù)作用與是否缺失SHP-1表達(dá)無關(guān)。與此同時,我們將小鼠腎臟缺血再灌注損傷后的組織進(jìn)行連續(xù)切片和免疫組化染色。發(fā)現(xiàn)SHP-1表達(dá)陽性的細(xì)胞與AQP-1(腎小管上皮細(xì)胞特征性表達(dá)的蛋白)表達(dá)陽性的細(xì)胞位置一致,而與F4/80(巨噬細(xì)胞特征性表達(dá)的蛋白)表達(dá)陽性的細(xì)胞位置不同,因此我們更加確信地將SHP-1發(fā)揮功能的細(xì)胞單位聚焦于腎小管上皮細(xì)胞中。為了揭示SHP-1在腎小管上皮細(xì)胞中如何發(fā)揮抗凋亡的作用,我們繼續(xù)構(gòu)建了體外細(xì)胞模型,以求探索SHP-1作用的機(jī)制。根據(jù)文獻(xiàn)中的方法,我們使用CoCl_2來模擬細(xì)胞缺氧損傷,進(jìn)而刺激腎小管上皮細(xì)胞(TCMK1)誘發(fā)凋亡。經(jīng)過時間和濃度的摸索,我們發(fā)現(xiàn)TCMK1受CoCl_2刺激產(chǎn)生的凋亡效應(yīng)是受時間和濃度依賴的。使用合適的濃度(200μmol/L)和時間(24 h)刺激TCMK1,相比于對照組,CoCl_2刺激后細(xì)胞凋亡水平和凋亡相關(guān)分子表達(dá)水平皆上調(diào),這些結(jié)果明確了細(xì)胞模型的有效性和穩(wěn)定性。為了驗(yàn)證SHP-1在細(xì)胞模型中的抗凋亡特性,我們構(gòu)建出了SHP-1過表達(dá)質(zhì)粒,并且包裝成慢病毒感染正常培養(yǎng)的TCMK1細(xì)胞。經(jīng)過后續(xù)的嘌呤霉素篩選和表達(dá)驗(yàn)證,我們拿到了具有穩(wěn)定過表達(dá)SHP-1能力的TCMK1單克隆細(xì)胞株(簡稱TCMK1OV)。我們立即開展了TCMK1 OV功能實(shí)驗(yàn),即使用CoCl_2以同樣刺激濃度和刺激時間分別刺激TCMK1 OV和感染空載對照病毒的細(xì)胞,評估凋亡水平。結(jié)果表明,與對照組的細(xì)胞相比,TCMK1 OV凋亡發(fā)生率顯著降低。為了全面評估凋亡水平,我們使用流式染色方案、免疫熒光染色以及免疫印跡等實(shí)驗(yàn)方法,這些結(jié)果均一致性地表明,過表達(dá)SHP-1顯著降低腎小管上皮細(xì)胞應(yīng)對缺氧所誘導(dǎo)的凋亡損傷。為全面論證SHP-1在腎小管上皮細(xì)胞中的抗凋亡作用,我們補(bǔ)充了將SHP-1基因從腎小管上皮細(xì)胞中敲除或敲低之后的功能實(shí)驗(yàn)。我們發(fā)現(xiàn)SHP-1表達(dá)下調(diào)后,應(yīng)對CoCl_2刺激凋亡顯著增多,與體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果也相吻合。據(jù)此,我們得出結(jié)論,SHP-1通過抑制凋亡的方式保護(hù)了腎小管上皮細(xì)胞應(yīng)對缺血再灌注損傷。上述的細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)與動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果相呼應(yīng),一致性地表明SHP-1抗凋亡的保護(hù)作用。并且我們在動物和細(xì)胞中檢測了凋亡的啟動開關(guān)——caspase 3的剪切活化,結(jié)果均表明SHP-1抗凋亡效應(yīng)是通過調(diào)節(jié)caspase 3的剪切活化來實(shí)現(xiàn)。但SHP-1如何更具體地調(diào)節(jié)caspase 3的剪切活化,目前尚未知曉。導(dǎo)致這一狀況的原因之一就是SHP-1在腎小管上皮細(xì)胞中發(fā)揮功能的亞細(xì)胞定位目前不明。它既有可能在胞漿中行使常規(guī)的磷酸酶功能,也有可能如少數(shù)文獻(xiàn)所述的入核發(fā)揮作用。為了輔助判斷,我們使用細(xì)胞免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)予以確定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SHP-1是作為腎小管上皮細(xì)胞中的胞漿分子發(fā)揮磷酸酶的作用,這一結(jié)論也為下一步的作用機(jī)制探討提供了方向。為了能明確SHP-1在胞漿中的作用靶點(diǎn),我們篩選了凋亡信號通路中潛在的SHP-1作用底物。Caspase 3的活化剪切是凋亡信號通路最終活化的重要標(biāo)志,在篩選SHP-1可能作用的靶點(diǎn)時,我們也將能調(diào)控caspase 3剪切活化的分子作為篩選標(biāo)準(zhǔn)之一。MAPK信號通路分子廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、炎癥和凋亡等過程,且有文獻(xiàn)報道其參與活化caspase 3的信號網(wǎng)絡(luò)。MAPK是經(jīng)典的三次級聯(lián)信號激活模式,即MAPKKK/MAPKK/MAPK。其中,MAPK中與凋亡存在明確調(diào)控關(guān)系的是JNK。ASK1屬于MAPKKK家族的一員,同時是JNK的上游調(diào)控分子。我們通過文獻(xiàn),發(fā)現(xiàn)了ASK1分子與SHP-1之間存在聯(lián)系。我們檢測了不同表達(dá)狀態(tài)下的SHP-1所對應(yīng)的ASK1的表達(dá)量,我們發(fā)現(xiàn)在mRNA或蛋白水平上SHP-1的表達(dá)與ASK1的表達(dá)無關(guān)聯(lián)性。在排除SHP-1在表達(dá)上對ASK1的調(diào)控作用,并結(jié)合SHP-1酪氨酸磷酸酶的功能進(jìn)行推測,結(jié)果表明SHP-1過表達(dá)后可以顯著抑制ASK1的酪氨酸磷酸化水平,即SHP-1調(diào)控的ASK1翻譯后的修飾。進(jìn)一步地,通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn),我們確認(rèn)了SHP-1可以與ASK1相互作用的關(guān)系。為了更加明確SHP-1和ASK1相互作用的結(jié)構(gòu)域,我們分別根據(jù)各自蛋白結(jié)構(gòu)構(gòu)建了不同的截短體,并通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SHP-1的羧基端磷酸酶結(jié)構(gòu)域是結(jié)合ASK1的必要條件,而ASK1的中段的激酶結(jié)構(gòu)域是結(jié)合SHP-1的必要條件。最后,我們回歸到信號通路分子的驗(yàn)證環(huán)節(jié),我們發(fā)現(xiàn)SHP-1敲除的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株與空載對照細(xì)胞株相比,經(jīng)CoCl_2刺激后ASK1的下游JNK磷酸化程度也增高。即SHP-1直接抑制ASK1的磷酸化,從而間接抑制了JNK的活化和后續(xù)的caspase 3的剪切活化,最終減輕凋亡反應(yīng)。綜上所述,本研究系統(tǒng)地探索了SHP-1在造血細(xì)胞之外,以腎小管上皮為代表的非造血細(xì)胞中的重要功能。我們明確了SHP-1在腎I/R損傷中的的抗凋亡作用和其作用機(jī)制,指出了SHP-1作用的靶分子——ASK1,同樣存在酪氨酸磷酸化的修飾方式,為將來研發(fā)藥物有效治療腎缺血再灌注損傷提供了理論支撐。
【圖文】：

圖 1-1 同源重組的原理（引自一步法克隆試劑盒說明書）設(shè)計好引物后，注意使用高保真 DNA 聚合酶，以防止在 DNA 擴(kuò)增階段所引突變。b. 短片段 DNA 分子短片段通常是用于 RNA 干擾和 CRISPR/Cas9 敲除質(zhì)粒的構(gòu)建。短片段的來源是單鏈的引物退火形成互補(bǔ)的雙鏈結(jié)構(gòu)。所以在設(shè)計好打靶序列后，兩端加上酶的黏性末端結(jié)構(gòu)，另一條互補(bǔ)鏈引物的設(shè)計就按照中間核心的打靶序列互補(bǔ)，兩按照黏性末端切口對應(yīng)的堿基。RNA 干擾質(zhì)粒構(gòu)建引物設(shè)計如下圖：

-1 同源重組的原理（引自一步法克隆試劑注意使用高保真 DNA 聚合酶，以防止在A 分子于 RNA 干擾和 CRISPR/Cas9 敲除質(zhì)粒的形成互補(bǔ)的雙鏈結(jié)構(gòu)。所以在設(shè)計好打靶另一條互補(bǔ)鏈引物的設(shè)計就按照中間核心對應(yīng)的堿基。RNA 干擾質(zhì)粒構(gòu)建引物設(shè)計
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R692

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本文編號：2628867