【摘要】：背景:局灶節(jié)段性腎小球硬化(focal segmental glomerular sclerosis,FSGS)是一種常見的腎病,常與蛋白尿和漸進性腎功能衰竭有關,其特征為足細胞損傷,腎小球毛細血管袢的缺失和塌陷。然而,FSGS的發(fā)病機制尚未完全闡明,近年來分子遺傳學的進展提供了越來越多的證據(jù)表明足細胞的結構和功能紊亂成為FSGS發(fā)病機制的關鍵。在本研究中,通過對一例FSGS患者行基因測序,找出致病基因并驗證其致病機制。方法:采用新一代測序技術(next-generation sequencing,NGS)篩出與FSGS致病相關基因,之后進行Sanger測序驗證,最后篩出致病基因。后提取先證者全血行RNA-PCR驗證,檢測致病基因mRNA表達水平,并通過免疫組織化學驗證其表達水平。體外實驗中,利用siRNA敲除足細胞中的候選致病基因進行功能驗證。通過流式細胞及凋亡蛋白caspase3的免疫印記檢測驗證細胞凋亡情況,查閱文獻可知細胞凋亡與線粒體功能障礙有關,之后通過mitosox檢測線粒體ROS生成及檢測線粒體結構蛋白F-actin的表達及排列驗證線粒體功能紊亂。結果:通過NGS和Sanger測序驗證篩選出可能的致病基因-COQ6。該基因(NM_182480)的第一外顯子exonl存在無義突變.;c.G41A:p.W14X,第41位密碼子的UGG變?yōu)閁GA(色氨酸變?yōu)榻K止密碼子)。先證者全血RNA的PCR檢測及免疫組化結果均顯示COQ6表達明顯下降。體外實驗中,RNAi抑制COQ6表達后,通過Annexin V/FITC結合流式細胞儀檢測到凋亡細胞數(shù)明顯增多,同時凋亡相關蛋白活性Capase-3的表達明顯增加。此時線粒體產(chǎn)生的ROS顯著增加(MitoSOX信號增強),結構蛋白F-actin排列紊亂。結論:COQ6的突變將影響線粒體的呼吸鏈功能,從而產(chǎn)生過多的ROS,導致足細胞骨架紊亂而誘導足細胞凋亡,這可能是該患者出現(xiàn)FSGS的可能機制。為今后的FSGS的篩查提供基本的理論依據(jù)。
【圖文】：

１：先證者腎臟病理圖，病理示ＦＳＧＳ。Ａ：光鏡下腎組織ＰＡＳ染色（２００Ｘ）邋；邋Ｂ：織ＰＡＭ染色（２００Ｘ）邋；邋Ｃ：電鏡下示足細胞足突融合及消失。逡逑先證者及其父親既往無蛋白尿或血尿的病史。其母親曾于我院行腎活檢：。此，證母的晨外周脈血

病變患者（對照組）的腎組織中進行了⑶Ｑ６、ＣＵＢＮ和ＡＰ０Ｌ１的免疫組織化學染色實逡逑驗。免疫組化結果顯示，先證者及其母親的⑶Ｑ６和⑶ＢＮ表達水平均顯著低于對照組逡逑（圖２）。然而，先證者ＡＰ０Ｌ１表達明顯高于對照組（圖２），，這與文獻［８］報道相矛盾，逡逑所以，ＡＰ０Ｌ１的致病可能被排除。由于⑶ＢＮ主要表達在腎小管［９］，而ＦＳＧＳ主要是逡逑腎小球病變，其特征是足細胞足突的缺失，因此ＣＵＢＮ的致病可能亦被排除，從而確逡逑認Ｃ０Ｑ６突變的致病作用。逡逑ＣＯＱ６逡逑４／；；：邋■＊邋＾．１－逡逑Ｖ邐．邋ｒ．邐；：？邐■逡逑＃求’域Ｕ．．逡逑ｃ＿逡逑ＣＯＮ邐Ｐ邐Ｍ逡逑圖２：邋Ｃ０Ｑ６，邋ＣＵＢＮ及ＡＰ０Ｌ１在腎臟組織的免疫組化結果。（Ｘ４００）逡逑ＣＯＮ：對照組，病理為微小病變；Ｐ：先證者，病理為ＦＳＧＳ；邋Ｍ：先證者母親，病理為ＦＳＧＳ。逡逑３．邐Ｃ０Ｑ６－ｍＲＮＡ在先證者全血中表達下降逡逑２０逡逑
【學位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R692.6

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本文編號：2615863