【摘要】：目的：探討前體蛋白加工酶PACE4在前列腺增生(Benign prostatic hyperplasia,BPH).前列腺上皮內(nèi)瘤變(Prostate intraepithelial neoplasia,PIN)及前列腺癌(Prostate cancer,PCa)組織中的表達(dá)及其與前列腺癌臨床分期、血清PSA水平、Gleason評(píng)分之間的關(guān)系；在細(xì)胞水平驗(yàn)證PACE4的表達(dá)與細(xì)胞增殖能力和侵襲能力的關(guān)系,預(yù)測(cè)分析PACE4的干擾niRNA,驗(yàn)證miR-124對(duì)前列腺癌細(xì)胞系DU145中PACE4表達(dá)調(diào)節(jié)以及細(xì)胞增值、遷徙和侵襲特性的影響,為前列腺癌的診斷、監(jiān)測(cè)以及隨診提供新的可供參考的標(biāo)志物,為前列腺癌的治療提供新的靶點(diǎn)。 方法：應(yīng)用免疫組化SP法檢測(cè)PACE4在72例前列腺癌、10例前列腺上皮內(nèi)瘤變和40例良性前列腺增生癥組織中的表達(dá),并與前列腺癌臨床分期、血清PSA水平及Gleason評(píng)分之間的關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；培養(yǎng)前列腺癌細(xì)胞系DU-145、PC.3.LNCaP.C42和前列腺增生細(xì)胞株BPH-1,細(xì)胞計(jì)數(shù)、軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證細(xì)胞株的增殖能力和侵襲能力,應(yīng)用Realtime PCR.Westernblot檢測(cè)各細(xì)胞株中PACE4及相關(guān)信號(hào)分子的表達(dá)狀況,應(yīng)用免疫熒光染色顯示各細(xì)胞中PACE4的表達(dá)。預(yù)測(cè)分析PACE4的干擾miRNA,檢測(cè)PACE4高表達(dá)、低表達(dá)和不表達(dá)的DU-145.C42和BPH-1中所預(yù)測(cè)niRNA的表達(dá),根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,通過與信息庫比對(duì)預(yù)測(cè)miR-124直接靶向PACE4-3'UTR,利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)確定目標(biāo)miRNAs,構(gòu)建pMIR-Report-PACE43'UTR報(bào)告質(zhì)粒和pMIR-Report-mut-PACE43'UTR報(bào)告質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞和熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)分析結(jié)果。設(shè)計(jì)、合成miR-124的oligo片段和inhibitor片段,脂質(zhì)體LipofectamineTM RNAiMAX將其轉(zhuǎn)染進(jìn)入DU-145、C42和BPH-1細(xì)胞內(nèi),Realtime PCR和Westernbloting檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PACE4mRNA和蛋白水平的表達(dá)。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)DU145細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-124以后的細(xì)胞周期變化,分析細(xì)胞增殖能力；利用Martrix膠侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力變化。采用免疫細(xì)胞染色檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-124后,DU-145細(xì)胞表達(dá)MUC1的變化,并將實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。 結(jié)果：(1)PACE4在PCa.PIN及BPH中的陽性率分別為92%、80%及20%,PCa和BPH兩組中的陽性表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而在PCa和PIN中的陽性表達(dá)無明顯差異(P0.05).PACE4在前列腺癌中的表達(dá)與患者臨床分期.血清PSA水平、腫瘤分級(jí)(Gleason評(píng)分)密切相關(guān)(P0.05).PACE4陽性率與腫瘤臨床分期呈正相關(guān)(P0.01),Ⅰ期和Ⅲ期、Ⅳ期之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與Gleason評(píng)分呈正相關(guān)(P0.01),隨腫瘤Gleason評(píng)分的增高PACE4陽性率呈上升趨勢(shì)。術(shù)前PSA水平10ng/ml和20ng/ml兩組組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。PACE4在有無骨轉(zhuǎn)移兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 (2)培養(yǎng)前列腺癌細(xì)胞株DU-145、PC3、LNCaP、C42及前列腺增生細(xì)胞株BPH-1,其中DU-145細(xì)胞的增殖能力和侵襲能力最強(qiáng),C42在PCa細(xì)胞株中增殖能力和侵襲能力最弱。利用Realtime PCR和Western blot檢測(cè)細(xì)胞中PACE4及相關(guān)信號(hào)分子的表達(dá),發(fā)現(xiàn)PACE4在DU-145中表達(dá)最高,前列腺癌細(xì)胞株中C42較少,所有細(xì)胞株中BPH-1最少,同時(shí)其關(guān)信號(hào)分子基因水平IGFBP3和THBS1表達(dá)及Furin、Seprine2、MUC、CDK6高表達(dá),蛋白水平P53、MUC1及PTEN高表達(dá),細(xì)胞免疫熒光顯示DU145細(xì)胞中PACE4的表達(dá)也最高,以上結(jié)果提示PACE4表達(dá)水平與前列腺癌惡性程度及侵犯轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。 (3)利用生物學(xué)軟件預(yù)測(cè)分析PACE4的干擾miRNAs,根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果選取mir-9-5p、mir-506-3p、hsa-mir-124-3p、mir-590-5p和mir-21-5p,選用明確的PACE4高表達(dá)、低表達(dá)和不表達(dá)的DU-145、C42和BPH-1通過Realtime PCR檢測(cè)以上miRNAs的表達(dá),發(fā)現(xiàn)miR-124、miR-21在DU-145中的表達(dá)明顯低于在BPH-1中的表達(dá),miR-124、miR-21在DU-145和BPH-1中表達(dá)存在明顯差異(P0.05)；雙熒光素酶檢測(cè)niRNA與PACE43'UTR的關(guān)系,并轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)分析結(jié)果,過表達(dá)miR-124和miR-21后,報(bào)告系統(tǒng)的熒光值顯著減少(P0.05),提示miR-124、miR-21與PACE43'UTR存在靶向關(guān)系；將miR-124轉(zhuǎn)染進(jìn)入DU-145、C42和BPH-1細(xì)胞內(nèi),Realtime PCR和、Vestern blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PACE4mRNA和蛋白水平的表達(dá),并檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-124以后的細(xì)胞周期變化,分析細(xì)胞增殖能力及侵襲能力的變化。發(fā)現(xiàn)將miR-124轉(zhuǎn)染DU-145細(xì)胞后,轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力減低,細(xì)胞周期阻滯,而轉(zhuǎn)染了miR-124inhibitor片段C42細(xì)胞和BPH-1細(xì)胞的細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力升高,細(xì)胞表達(dá)MUC1水平也同時(shí)升高,而轉(zhuǎn)染miR-124后DU145細(xì)胞表達(dá)MUC-1顯著減少。提示miRNA可通過抑制PACE的表達(dá)使細(xì)胞的增殖和遷移能力下降,細(xì)胞的惡性都減少。 結(jié)論：前列腺癌組織中PACE4高表達(dá),并與前列腺癌的臨床分期、血清PSA水平及Gleason評(píng)分有密切相關(guān),提示PACE4可作為前列腺癌的一個(gè)有價(jià)值的診斷指標(biāo)。預(yù)測(cè)分析PACE4的干擾miRNA, miR-124可直接靶向PACE4-3'UTR,將miR-124轉(zhuǎn)染DU-145后細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力減低,細(xì)胞周期阻滯,提示miR-124可通過抑制PACE4的轉(zhuǎn)錄來抑制前列腺癌的增值和轉(zhuǎn)移。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R737.25

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2551589