【摘要】：目的：：腎臟隨年齡的增長(zhǎng)出現(xiàn)腎小球硬化及腎小管-間質(zhì)纖維化，主要原因是胞外基質(zhì)（ECM）的大量堆積。腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)改變（EMT）被認(rèn)為是ECM過度沉積的主要原因之一。既往研究發(fā)現(xiàn)腎臟衰老常伴隨腎間質(zhì)纖維化，并有部分研究證明，SASP在衰老相關(guān)纖維化中扮演重要角色，但具體機(jī)制尚不清楚。因此，本研究利用腎臟自然衰老以及長(zhǎng)期限食延緩腎臟衰老模型，探索分泌性microRNA對(duì)腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)改變產(chǎn)生影響的可能機(jī)制，為臨床預(yù)防及延緩腎臟衰老相關(guān)纖維化提供重要線索。 方法：1.實(shí)驗(yàn)用F344雄性大鼠，分為3組：YAL：3月齡，自由飲食；OAL：24月齡，自由飲食；OCR：24月齡，限食8個(gè)月，飲食熱量為OAL的70%。體內(nèi)試驗(yàn)利用SA-β-gal染色，Masson染色、免疫組化、western blot比較三組大鼠腎臟衰老、腎間質(zhì)纖維化、EMT程度及過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARα)、低氧誘導(dǎo)因子HIF1α指標(biāo)的變化；利用QRT-PCR比較三組腎組織以及尿液微囊泡中miR-21的表達(dá)情況。 2.分離培養(yǎng)人原代近端腎小管上皮細(xì)胞（HPTCs）并鑒定,高糖（33mM）刺激不同時(shí)間，通過western blot、SA-β-gal染色、細(xì)胞免疫熒光觀察衰老與EMT之間的先后關(guān)系。 3.為明確衰老HPTCs是否通過旁分泌含有miR-21微囊泡促進(jìn)鄰近細(xì)胞發(fā)生EMT，限食是否延緩衰老進(jìn)而抑制微囊泡中miR-21分泌，我們利用白藜蘆醇模擬體外限食，分三步驟：首先高糖(HG)或者HG和白藜蘆醇共刺激HPTCs，觀察細(xì)胞衰老情況、以及微囊泡、細(xì)胞中miR-21的含量；其次，比較對(duì)照組、HG、HG和miR-21inhibitor、miR-21mimics組中細(xì)胞及微囊泡中miR-21含量；最后收集前者所述各分組中所分泌微囊泡刺激受體HPTCs，觀察受體細(xì)胞EMT發(fā)生。 4.為進(jìn)一步研究miR-21是否通過靶向調(diào)控PPARα，經(jīng)HIF1α促進(jìn)腎臟纖維化，我們利用非諾貝特激動(dòng)PPARα,siRNA技術(shù)敲除HIF1α，驗(yàn)證miR-21-PPARα-HIF1α在腎臟纖維化過程中所起作用。 結(jié)果：1.長(zhǎng)期限食能明確改善大鼠衰老及纖維化，并降低衰老腎組織或者尿液外泌體中miR-21的表達(dá)。PPARα蛋白表達(dá)高低順序?yàn)閅ALOCROAL,HIF1α表達(dá)高低順序?yàn)镺ALOCRYAL。 2.高糖誘導(dǎo)HPTCs24h后出現(xiàn)SA-β-gal染色陽(yáng)性，腎小管上皮細(xì)胞細(xì)胞衰老表型（P53、P21表達(dá)升高，P0.05）發(fā)生。而高糖刺激48h后EMT標(biāo)志物vimentin及α-SMA升高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p0.05）,72h后E-cadherin下降具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且細(xì)胞的免疫熒光顯示，相比0h，高糖刺激72h E-caherin表達(dá)明顯下降，α-SMA表達(dá)明顯升高因此，明確高糖誘導(dǎo)的HPTCs衰老表型改變?cè)缬贓MT。 3.收集微囊泡刺激正常HPTCs48h，與control比較，HG、miR-21mimics組細(xì)胞及微囊泡中miR-21升高（P0.05），E-cadherin下降，vimentin及α-SMA表達(dá)升高（P0.05）;與HG比較， HG+RSV、HG+miR-21inhibitor組細(xì)胞及微囊泡中miR-21降低（P0.05），E-cadherin上升，vimentin及α-SMA表達(dá)降低（P0.05）。 4.將miR-21mimics或miR negative control轉(zhuǎn)染HPTCs細(xì)胞，檢測(cè)PPARα的表達(dá)改變。與control、miR negative control組相比，miR-21mimics組的PPARα的蛋白表達(dá)下降(p0.05)，而PPARα的mRNA水平?jīng)]有變化(p0.05)，表明，miR-21可能通過轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)PPARα進(jìn)行調(diào)控。結(jié)合既往研究結(jié)果，PPARα是miR-21的直接靶基因。 5.將miR-21inhibitor或miR-21mimics轉(zhuǎn)染HPTCs,24h后換液，miR-21inhibitor組給予HG刺激，48h后觀察各組EMT程度。與control、miR negative control比較，HG、miR-21mimics、HG+miR negative control組，E-cadherin下降，vimentin及α-SMA表達(dá)升高（P0.05），HIF1a升高（P0.05）；與HG組比較，HG+miR-21inhibitor組, E-cadherin升高，vimentin及α-SMA表達(dá)降低（P0.05），HIF1α降低（P0.05）。 6.選用PPARα激動(dòng)劑非諾貝特(Fenofibrate)和HG/miR-21mimics共刺激HPTCs。與HG、miR-21mimics組比較，HG+Fenofibrate、miR-21mimics+Fenofibrate組,E-cadherin升高，vimentin及α-SMA表達(dá)降低（P0.05），HIF1a降低（P0.05）。 7.通過siRNA-HIF1α抑制HIF1α的活性,與HG、HG+NC組比較，，HG+siHIF1α組E-cadherin升高，vimentin及α-SMA表達(dá)降低（P0.05）；與mimics、mimics+NC組比較，mimics+siHIF1α組E-cadherin升高，vimentin及α-SMA表達(dá)降低（P0.05）。 結(jié)論：1.長(zhǎng)期限食可延緩衰老及衰老相關(guān)纖維化，并降低衰老腎組織及尿液微囊泡中miR-21表達(dá)。 2.白藜蘆醇模擬體外限食可改善高糖誘導(dǎo)的人近端腎小管上皮細(xì)胞衰老并阻止其旁分泌含有miR-21微囊泡促進(jìn)EMT這一過程。 3.MiR-21靶向調(diào)控PPARα，通過HIF1α促進(jìn)人腎近端腎小管上皮細(xì)胞EMT發(fā)生。
【圖文】：

借鑒上述低氧所致腎間質(zhì)纖維化的干預(yù)措施,應(yīng)用于自然衰老模型中改善低氧所致腎間質(zhì)纖維化是否可行需進(jìn)一步驗(yàn)證。圖2.1 缺氧與腎間質(zhì)纖維化形成閉合回路示意圖2.4 小結(jié)衰老伴隨動(dòng)脈增厚,硬化導(dǎo)致組織灌注降低,腎臟是衰老相關(guān)組織損傷的重要靶器官,對(duì)缺血缺氧異常敏感；另外腎臟衰老特征為腎間質(zhì)纖維化,PTCs下降。二者均能引起腎組織低氧,通過HIF依賴或者非HIF依賴途徑影響腎臟纖維化,形成一個(gè)閉合循環(huán)回路加速腎功能惡化,最終引起終末期腎臟病(圖2.1)。老年個(gè)體血管硬化引起組織低氧及乏氧耐受性降低逐漸引起重視

長(zhǎng)期限食延緩腎臟衰老以及腎臟纖維化
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R692

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 孫雪峰;;K/DOQI慢性腎臟病臨床實(shí)踐指南只能借鑒 尚須完善[J];中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志;2007年22期

2 蔡廣研;陳香美;師鎖柱;高波;張雪光;王兆霞;;腎小管上皮細(xì)胞標(biāo)志物隨增齡變化及其意義[J];中華老年醫(yī)學(xué)雜志;2005年12期

本文編號(hào)：2518534