本文關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)組學研究熱應激引起大鼠附睪頭早期微環(huán)境的變化

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【摘要】：目的建立雄性大鼠生殖系統(tǒng)熱應激模型,研究急性熱應激對附睪精子成熟微環(huán)境的影響:利用蛋白質(zhì)組學技術(shù)鑒定附睪熱應激相關(guān)蛋白表達譜,探討熱應激對于附睪早期微環(huán)境的影響,為附睪精子成熟和男性避孕研究提供實驗依據(jù)。方法1.將47只大鼠分成三部分:取3只大鼠構(gòu)建大鼠附睪(頭)蛋白表達譜;取12只大鼠分成4組:正常對照組、42℃30min組、42℃60min組和42℃120min組,每組3只,做精子活力分析;取32只雄性SD大鼠(300-400g)分成兩組,熱應激組和對照組各16只。通過將大鼠的睪丸浸泡于42℃水浴中溫浴不同時間建立熱應激模型;對照組將大鼠于室溫水浴中建立對照組。2.利用精子分析儀對精子活力進行分析;3.HE染色后光鏡下觀察附睪組織的形態(tài)學變化。4.蛋白質(zhì)組學平臺上:利用二維凝膠電泳分離熱應激和對照組蛋白,建立蛋白表達譜,然后再用Image Master 2D Flatinum軟件對凝膠進行掃描并尋找表達上調(diào)與下調(diào)的蛋白膠點,最后取膠點脫色溶出凝膠蛋白,點靶后用通過5800 MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀鑒定表達蛋白,建立差異附睪頭蛋白表達譜和熱應激相關(guān)差異蛋白表達譜;綜合利用生物信息學工具(Gene Ontology,PIR,DAVID)分析差異蛋白分子生物學功能和參與的分子生物學過程。5.分別選取熱應激后的上調(diào)蛋白和下調(diào)蛋白中關(guān)鍵的差異蛋白,進行免疫組化和蛋白印跡法驗證。6.細胞凋亡法檢測附睪組織經(jīng)過熱應激后的凋亡情況。結(jié)果1.精子活力分析顯示42℃水浴時間超過60min時大鼠的精子活力開始明顯下降,本研究選擇溫浴60min建立大鼠附睪熱應激模型。2.通過蛋白質(zhì)組學建立了大鼠附睪頭部蛋白表達譜,鑒定出150個蛋白;熱應激相關(guān)差異蛋白點鑒定出92個,利用MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜共鑒定非冗余差異蛋白21個,其中熱應激相關(guān)上調(diào)蛋白11個,下調(diào)蛋白10個。3.HE染色顯示熱應激組的附睪組織相對于對照組沒有明顯的形態(tài)學變化,但熱應激組出現(xiàn)附睪上皮組織細胞核空泡化。4.免疫組織化學和蛋白印跡法證實了Prdx6和Clu在熱應激組表達顯著下降,SOD1在熱應激組表達增高的差異表達趨勢。5.細胞凋亡檢測發(fā)現(xiàn)熱應激組細胞凋亡明顯增加。結(jié)論構(gòu)建了大鼠附睪急性熱應激模型,通過蛋白質(zhì)組學鑒定了熱應激相關(guān)蛋白表達譜,并驗證了熱應激對附睪蛋白表達的影響以及引起附睪微環(huán)境的變化,為附睪生理功能和精子成熟研究提供了有用的信息。
【學位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R697
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本文編號：1136657