本文關(guān)鍵詞：晚期氧化蛋白產(chǎn)物對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨及滑膜影響的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是一種常見(jiàn)的慢性退行性關(guān)節(jié)疾病,典型的病理改變包括軟骨的降解、滑膜的炎癥、骨贅形成以及軟骨下骨骨重塑等,因此它也是一種累及全關(guān)節(jié)的疾病。流行病學(xué)調(diào)查未發(fā)現(xiàn)其有明顯的種族與地域性差異。在50歲以上的人群中,骨關(guān)節(jié)炎的致殘比例約為2%～6%,這一比例在導(dǎo)致長(zhǎng)期殘疾的人類疾病中僅次于心血管疾病。由于其在中老年人中的發(fā)病率和致殘率較高,骨關(guān)節(jié)炎被認(rèn)為是影響人類健康最常見(jiàn)的疾病之一。據(jù)美國(guó)調(diào)查機(jī)構(gòu)統(tǒng)計(jì),因骨關(guān)節(jié)炎導(dǎo)致的醫(yī)療費(fèi)用開(kāi)支和其他經(jīng)濟(jì)損失年均高達(dá)1500億美元,而其中一半以上消耗源于骨關(guān)節(jié)炎患者勞動(dòng)能力的喪失。骨關(guān)節(jié)炎患者最主要的臨床癥狀為關(guān)節(jié)疼痛,因而較其它關(guān)節(jié)疾病而言,骨關(guān)節(jié)炎更加容易限制患者的下肢運(yùn)動(dòng)能力,從而導(dǎo)致患者的長(zhǎng)期勞動(dòng)能力喪失,最終阻礙了社會(huì)與經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis, KOA)在骨關(guān)節(jié)炎中較常見(jiàn),是一種慢性進(jìn)行性骨關(guān)節(jié)病,多見(jiàn)于中老年人。據(jù)國(guó)外統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)55～64歲的中老年人發(fā)病率高達(dá)40%。KOA病理改變主要為關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)崩解以及軟骨細(xì)胞數(shù)量的減少。隨著對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎的研究不斷深入,越來(lái)越多的致病因素被發(fā)現(xiàn),然而其病因及病理機(jī)制卻仍不明確。各種因素導(dǎo)致的關(guān)節(jié)軟骨損傷在生物學(xué)和形態(tài)學(xué)上高度一致,病變常常波及整個(gè)關(guān)節(jié),包括關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨、滑膜、關(guān)節(jié)滑液甚至韌帶和周圍的肌肉組織。膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展的最終結(jié)果是關(guān)節(jié)正常結(jié)構(gòu)的破壞以及關(guān)節(jié)功能的喪失,臨床上患者常常因劇痛難忍而長(zhǎng)期無(wú)法進(jìn)行下肢活動(dòng)。這些既影響了患者的生活質(zhì)量也阻礙了社會(huì)的發(fā)展。因此,明確骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制對(duì)整個(gè)OA的防控工作具有越來(lái)越重要的意義。人體內(nèi)氧化還原反應(yīng)失衡導(dǎo)致活性氧類物質(zhì)(Reactive Oxygen Species,ROS)積聚,最終引發(fā)氧化應(yīng)激。機(jī)體在氧化應(yīng)激狀態(tài)下,大分子結(jié)構(gòu)物質(zhì)如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA、RNA等因遭受氧化損傷而喪失正產(chǎn)的結(jié)構(gòu)和功能,其中最易受到損傷的是蛋白質(zhì)。而晚期氧化蛋白產(chǎn)物(Advanced Oxidation Protein Products, AOPPs)主要就是由體內(nèi)血漿中白蛋白在氧化應(yīng)激狀態(tài)下經(jīng)氧化修飾而生成的一種雙酪氨酸蛋白交聯(lián)物,AOPPs最早被發(fā)現(xiàn)是在慢性腎功能衰竭(Chronic Renal Failure,CRF)的患者血漿中,最終證實(shí)其主要是由血清中的白蛋白被機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的氧自由基和反應(yīng)性氧氧化而生成。臨床進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),慢性腎衰竭患者以及進(jìn)行過(guò)血液透析的患者體內(nèi)均存在較常人更高濃度的AOPPs,且與上述疾病與相關(guān)的長(zhǎng)期并發(fā)癥存在直接關(guān)系。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí),晚期氧化蛋白產(chǎn)物也能在體外進(jìn)行合成,通過(guò)血漿或純化的血清白蛋白經(jīng)次氯酸氧化反應(yīng)即可得到,且加入的次氯酸劑量與晚期氧化蛋白產(chǎn)物生成濃度呈正相關(guān)性。蛋白被氧化后會(huì)生成一種特有的雙酪氨酸結(jié)構(gòu),人體血漿中晚期氧化蛋白產(chǎn)物濃度與雙酪氨酸及蛋白質(zhì)糖基化標(biāo)志物戊糖苷濃度呈正比,因此可以認(rèn)為晚期氧化蛋白產(chǎn)物是一種良好的氧化應(yīng)激標(biāo)志物,可特異性的評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)受氧化的程度。近十幾年的研究發(fā)現(xiàn),晚期氧化蛋白產(chǎn)物除了在尿毒癥患者體內(nèi)集聚外,它還與眾多疾病相關(guān)。其中在對(duì)血液透析患者的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)此類患者血漿中的晚期氧化蛋白產(chǎn)物濃度與頸動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度呈明顯的相關(guān)性。同時(shí)又有研究發(fā)現(xiàn)慢性腎臟疾病(Chronic Kidney Disease, CKD)患者早期血漿中的晚期氧化蛋白產(chǎn)物濃度即顯著升高,并隨著腎功能惡化而進(jìn)行性升高。Piwowar等發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者血漿晚期氧化蛋白產(chǎn)物濃度明顯高于正常人,并與體內(nèi)氧化及抗氧化標(biāo)記物濃度呈相關(guān)性,研究還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)有微血管病變的糖尿病患者,其血漿晚期氧化蛋白產(chǎn)物濃度也明顯高于無(wú)病變患者。在對(duì)冠心病人群進(jìn)行的一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn),冠心病患者血液中晚期氧化蛋白產(chǎn)物濃度明顯高于正常人,并與冠心病的嚴(yán)重程度呈相關(guān)性,被認(rèn)為是冠心病的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。研究還發(fā)現(xiàn)冠心病病人血漿中晚期氧化蛋白產(chǎn)物與巰基比例明顯升高,此研究認(rèn)為晚期氧化蛋白產(chǎn)物與巰基比例升高可作為急性冠脈綜合征發(fā)作的標(biāo)志。過(guò)往文獻(xiàn)報(bào)道有許多人類疾病都與晚期氧化蛋白產(chǎn)物的蓄積相關(guān),如過(guò)敏性紫癜、IgA腎病、慢性炎癥性腸病、肥胖、非酒精性脂肪肝、急性消化性潰瘍等。臨床上的研究促使學(xué)者們產(chǎn)生了對(duì)晚期氧化蛋白產(chǎn)物的興趣,越來(lái)越多的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)被用來(lái)驗(yàn)證晚期氧化蛋白產(chǎn)物的作用。在一項(xiàng)大鼠在體實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)晚期氧化蛋白產(chǎn)物能刺激糖尿病大鼠腎臟組織內(nèi)單核細(xì)胞趨化因子(Monocyte Chemotactic Protein-1)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(Transforming Growth Factor-β,TGF-β)等促炎細(xì)胞因子的合成與釋放,最終導(dǎo)致腎單位結(jié)構(gòu)破壞,尿蛋白排出量增加及血肌酐升高。另一項(xiàng)兔的在體實(shí)驗(yàn)證實(shí)晚期氧化蛋白產(chǎn)物能促進(jìn)正常新西蘭白兔大動(dòng)脈壁產(chǎn)生細(xì)胞炎癥和脂滴沉積,加速了高脂血癥新西蘭大白兔兔大動(dòng)脈粥樣斑塊的形成。通過(guò)上述動(dòng)物在體實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),在晚期氧化蛋白產(chǎn)物干預(yù)下,干預(yù)對(duì)應(yīng)的組織中活性氧自由基均明顯升高。Witko-Sarsat等通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步對(duì)晚期氧化蛋白產(chǎn)物的作用機(jī)制進(jìn)行了探究,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)晚期氧化蛋白產(chǎn)物能通過(guò)激活單核細(xì)胞誘導(dǎo)呼吸鏈爆發(fā),從而產(chǎn)生氧化應(yīng)激。此后又有研究證實(shí)不論是慢性腎衰和糖尿病患者體內(nèi)的晚期氧化蛋白產(chǎn)物,還是體外通過(guò)次氯酸氧化蛋白而產(chǎn)生的晚期氧化蛋白產(chǎn)物,它們均可通過(guò)細(xì)胞表面的晚期糖基化產(chǎn)物受體(Receptor of Advanced Glycation End Products, RAGE)介導(dǎo)的、ROS敏感的MAPK和NF-kB信號(hào)通路激活人血管內(nèi)皮細(xì)胞。除上述作用機(jī)制以外,研究還發(fā)現(xiàn)晚期氧化蛋白產(chǎn)物能促使腎小球系膜細(xì)胞內(nèi)形成超氧化物,最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(Transforming growth factor-β, TGF-β)的合成增加,并上調(diào)纖維蛋白和Ⅳ型膠原纖維基因及蛋白的表達(dá),導(dǎo)致系膜細(xì)胞外基質(zhì)沉積。晚期氧化蛋白產(chǎn)物還可介導(dǎo)腎臟足細(xì)胞損傷和凋亡,誘導(dǎo)心肌細(xì)胞死亡等。因此,晚期氧化蛋白產(chǎn)物不僅是氧化應(yīng)激的后果,其本身也是活性氧自由基的來(lái)源,作為一種重要的大分子炎癥介質(zhì)具有廣泛的病理作用,可能參與人類多種重要疾病的發(fā)生、發(fā)展。雖然骨關(guān)節(jié)炎的致病因素多種多樣,但經(jīng)過(guò)大量的研究后發(fā)現(xiàn)有兩種因子與骨關(guān)節(jié)炎聯(lián)系最為緊密,即基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)與白介素(Interleukin)。在骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的研究中發(fā)現(xiàn)無(wú)論是基質(zhì)金屬蛋白酶還是白介素,都參與關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的代謝活動(dòng)。軟骨基質(zhì)的降解更是與基質(zhì)金屬蛋白酶存在最直接的關(guān)系。MMPs是一種蛋白水解酶,但它的作用不僅僅局限在降解蛋白質(zhì),MMPs家族中的某些酶還能夠特異性的降解細(xì)胞外基質(zhì)(extra cenularmatrix,ECM)。如MMP-3,它屬于基質(zhì)分解素類的酶,廣泛存在與各種組織中,主要作用是降解Ⅳ型膠原和蛋白聚糖以及與細(xì)胞內(nèi)粘性相關(guān)的層粘連蛋白、纖維連接蛋白。還有MMP-13,它屬于間質(zhì)膠原酶類,能夠特異性的降解膠原,包括軟骨中廣泛存在的Ⅱ型膠原就是其底物之一。本課題組前期研究證實(shí)了晚期氧化蛋白產(chǎn)物能通過(guò)NADPH氧化酶依賴的NF-κB通道誘導(dǎo)小鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞的炎癥反應(yīng),使滑膜細(xì)胞中MMP-3與MMP-13表達(dá)上調(diào)。同時(shí)我們也證實(shí)了晚期氧化蛋白產(chǎn)物能通過(guò)刺激ROS的生成而抑制成骨樣細(xì)胞的增值與分化。然而晚期氧化蛋白產(chǎn)物否在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展過(guò)程中對(duì)軟骨和滑膜產(chǎn)生影響尚不清楚。因此我們假設(shè)晚期氧化蛋白產(chǎn)物在骨關(guān)節(jié)炎的病程中亦能對(duì)軟骨和滑膜產(chǎn)生不利影響,其有能是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病的重要因素之一。為了證實(shí)上述假設(shè),本研究采用新西蘭大白兔行膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶離斷與內(nèi)側(cè)半月板部分切除術(shù)建立骨關(guān)節(jié)炎模型后于關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射一定濃度晚期氧化蛋白產(chǎn)物,觀察并分析關(guān)節(jié)軟骨的大體形態(tài),滑膜的相關(guān)蛋白表達(dá),探討氧化修飾蛋白質(zhì)對(duì)關(guān)節(jié)軟骨、滑膜組織的病理學(xué)作用及其與骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)系。研究目的1.探討外源性晚期氧化蛋白產(chǎn)物(AOPPs)對(duì)兔骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨組織大體形態(tài)的影響。2.探討外源性晚期氧化蛋白產(chǎn)物(AOPPs)對(duì)滑膜組織中基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)的影響。研究方法1.體外制備AOPPs修飾的兔血清白蛋白(AOPPs-RSA)。將兔血清白蛋白與次氯酸溶液以摩爾比例1：140混勻后,室溫下反應(yīng)30min,加入透析膜中并將透析膜在磷酸鹽緩沖液中透析24小時(shí)去除游離次氯酸,將所得樣品用濾器過(guò)濾去除內(nèi)毒素,經(jīng)鱟實(shí)驗(yàn)法測(cè)定內(nèi)毒素含量低于0.25EU/ml。AOPPs-RSA中AOPPs含量的測(cè)定：以氯胺T為標(biāo)準(zhǔn)曲線,測(cè)定酸性條件下340nm吸光度值。最終將制備好的AOPPs稀釋至0.20mg/ml后保存于-20℃冰箱備用。2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的藥物干預(yù)及取材。購(gòu)買5月齡雄性新西蘭大白兔(南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)48只,體重2.0～2.5kg。飼養(yǎng)于適宜的環(huán)境中,給予充足的水與食物,嚴(yán)格晝夜周期。經(jīng)10天適應(yīng)環(huán)境后將48只雄性新西蘭大白兔隨機(jī)分假手術(shù)組(Sham-operated)、對(duì)照組(ACLT+MMx/PBS)和干預(yù)組(ACLT+MMx/AOPPs),每組16只。采用膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶離斷與內(nèi)側(cè)半月板部分切除術(shù)(ACLT+MMx)建立骨關(guān)節(jié)炎模型。假手術(shù)組：采用與造模手術(shù)相同的手術(shù)入路打開(kāi)關(guān)節(jié)腔,顯露前交叉韌帶后縫合切口。對(duì)照組與干預(yù)組均采用ACLT+MMx造成骨關(guān)節(jié)炎模型。給予2周時(shí)間愈合手術(shù)傷口后,干預(yù)組行l(wèi)ml AOPPs(200μg/ml)隔日關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射,對(duì)照組給予同等劑量磷酸鹽緩沖液關(guān)節(jié)腔內(nèi)隔日注射,假手術(shù)組不做任何處理。在關(guān)節(jié)腔注射開(kāi)始4w、8w后隨機(jī)取每組中的8只經(jīng)麻醉后以耳緣靜脈注射空氣處死,分離雙側(cè)股骨及脛骨標(biāo)本。關(guān)節(jié)標(biāo)本的股骨與脛骨分離后剝除表面軟組織,生理鹽水紗布包埋后儲(chǔ)存于-80℃冰箱備用。3.檢測(cè)指標(biāo)：(1)對(duì)膝關(guān)節(jié)標(biāo)本行肉眼大體觀察,取股骨髁作為組織標(biāo)本,行India ink大體標(biāo)本染色,并以India ink染色大體評(píng)分法對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物關(guān)節(jié)損傷進(jìn)行評(píng)價(jià)。(2)股骨髁切片行番紅O固綠染色。以Mankin評(píng)分為標(biāo)準(zhǔn),對(duì)兔骨關(guān)節(jié)炎模型關(guān)節(jié)軟骨的損傷進(jìn)行評(píng)價(jià)。(3)取關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜組織為標(biāo)本,提取滑膜組織中蛋白并通過(guò)蛋白印跡實(shí)驗(yàn)(Western-blot)檢測(cè)滑膜組織中基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMPs) MMP-3與MMP-13的表達(dá)量。研究結(jié)果1. AOPPs組4周和8周India ink染色大體觀察評(píng)分分別為(4.19±0.60)、(5.75±0.60),假手術(shù)組分別為(1.06±0.18)、(1.38±0.60),磷酸鹽緩沖液組分別為(2.50±0.46)、(3.06±0.62),磷酸鹽緩沖液組的India ink大體評(píng)分在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)上均較假手術(shù)組高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05). AOPPs組的India ink染色大體評(píng)分在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)均較另外兩組高,且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.組織學(xué)觀察AOPPs組4周和8周Mankin評(píng)分分別為(8.19±0.70)、(11.94±0.90),假手術(shù)組分別為(0.75±0.53)、(1.06±0.73),磷酸鹽緩沖液組分別為(4.25±1.46)、(4.50±0.89),磷酸鹽緩沖液組的Mankin評(píng)分在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)上均高于假手術(shù)組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05). AOPPs組的Mankin評(píng)分在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)上均高于另外兩組,且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3. AOPPs組4周和8周滑膜組織中MMP-3、MMP-13相對(duì)表達(dá)量分別為(1.006±0.080)、(1.098±0.088),假手術(shù)組分別為(0.066±0.006)、(0.053±0.011),磷酸鹽緩沖液組分別為(0.552±0.024)、(0.839±0.084)。磷酸鹽緩沖液組滑膜組織中MMP-3、MMP-13的表達(dá)量在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)均較假手術(shù)組高,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。AOPPs組4周和8周滑膜組織中MMP-3、 MMP-13的表達(dá)量均較其它兩組高,且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論：外源性AOPPs刺激滑膜細(xì)胞MMP-3、MMP-13表達(dá)上調(diào),加速軟骨退變。
【關(guān)鍵詞】：骨關(guān)節(jié)炎 晚期氧化蛋白產(chǎn)物 軟骨 滑膜 基質(zhì)金屬蛋白酶
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R684.3
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-19
• 前言19-28
• 第一章 新西蘭大白兔骨關(guān)節(jié)炎模型的建立及AOPPs的制備28-36
• 材料與方法28-34
• 結(jié)果34
• 討論34-35
• 結(jié)論35-36
• 第二章 晚期氧化蛋白產(chǎn)物對(duì)OA軟骨大體形態(tài)的影響36-48
• 材料與方法36-39
• 結(jié)果39-45
• 討論45-47
• 結(jié)論47-48
• 第三章 晚期氧化蛋白產(chǎn)物對(duì)OA滑膜中MMP3、MMP13表達(dá)的影響48-56
• 材料與方法48-51
• 結(jié)果51-52
• 討論52-55
• 結(jié)論55-56
• 全文結(jié)論56-57
• 參考文獻(xiàn)57-66
• 攻讀學(xué)位期間成果66-67
• 附錄 中英文對(duì)照縮略詞表67-68
• 致謝68-70

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 葉丹麗;劉慶;胡昕;;滑膜在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病中的作用研究進(jìn)展[J];北方藥學(xué);2014年02期

2 Jie Shen;Shan Li;Di Chen;;TGF-，

本文編號(hào)：335323