本文關(guān)鍵詞：細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡與外燥傷肺病機(jī)的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：肺吸入自然界之清氣且散納有度,氣道潔凈則貴在流通宣暢。與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的小血管、微血管包括微循環(huán)高度相關(guān)的豐富肺絡(luò)脈是“肺司呼吸”功能的物質(zhì)基礎(chǔ)。氣體與肺毛細(xì)血管血液之間進(jìn)行氣體交換所通過的六層厚約0.2 μm-1μm的組織結(jié)構(gòu)稱為呼吸膜(respiratory membrane, RM),其擴(kuò)散速率與RM厚度呈反比。精細(xì)的解剖學(xué)知識(shí)與生理學(xué)機(jī)制將為呼吸膜與“肺司呼吸”理論在微觀結(jié)構(gòu)層次、體內(nèi)外氣體交換功能和多以喘咳主癥的相似性提供生理、生化、病理等客觀標(biāo)準(zhǔn)與參照系,成為溝通人類證候與模型動(dòng)物證候的橋梁。外燥傷肺的病機(jī)實(shí)質(zhì)涉及外邪與機(jī)體微觀物質(zhì)如促炎細(xì)胞因子／抗炎細(xì)胞因子、水液代謝相關(guān)基因表達(dá)的平衡紊亂。查新資料顯示近20年未見相同研究報(bào)道。本學(xué)位論文課題以《內(nèi)經(jīng)》六淫外燥傷肺理論為指導(dǎo),以前期相關(guān)研究為基礎(chǔ),結(jié)合微超病理學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)理論與技術(shù),以氣道細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)平衡為切入點(diǎn),研究促炎細(xì)胞因子／抗炎細(xì)胞因子平衡失調(diào)、AQP5基因表達(dá)異常,證實(shí)“氣道細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡導(dǎo)致肺部炎性病理改變是傷肺喘咳證候物質(zhì)基礎(chǔ)”的假說(shuō),根據(jù)研究結(jié)果闡析氣道細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡導(dǎo)致外燥傷肺喘咳病機(jī)的物質(zhì)基礎(chǔ)及病理生理學(xué)機(jī)制,為推進(jìn)六淫傷肺喘咳共性物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),具有理論創(chuàng)新與臨床指導(dǎo)意義。材料：一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：昆明種小鼠(SPF級(jí),體重17±1g)132只,雌雄各半(湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：鄂準(zhǔn)字2008-2005)。小鼠經(jīng)數(shù)字法隨機(jī)分常溫常濕組、溫燥組、涼燥組,每組44只。二、主要儀器：LRH-250人工智能氣候箱,溫度(6-65℃)±1℃,相對(duì)濕度(30%-90%)±3%(廣東醫(yī)療器械廠),MASTER-K30H風(fēng)扇程控儀(韓國(guó)Best機(jī)電有限公司),HITACHI-7500透射電鏡(日本),BioTek酶標(biāo)儀(美國(guó)),熒光定量PCR系統(tǒng)(SLAN, HONGSHI,美國(guó)),掃描儀(V300, EPSON),徠卡普通與超薄切片機(jī)(德國(guó)),neofuge 15R冷凍離心機(jī)(heal force,中國(guó)香港),DYY-6c電泳儀(北京六一儀器廠),紫外分光光度計(jì)(752-P,上�，F(xiàn)科儀器有限公司)。三、主要試劑：NE(批號(hào)201310)、al-AT (201310)、ET (20038)、PAF (20204)單克隆抗體試劑盒(IBL-America公司);IL-10(1201267)與TNF-a (1201262)單克隆抗體試劑盒(美國(guó)RD公司)。兔抗小鼠AQP5多克隆抗體試劑盒(DA0648,200902,武漢博士德生物技術(shù)有限公司),生物素化羊抗兔二抗、SABC試劑盒、DAB、L-多聚賴氨酸及陽(yáng)性對(duì)照片均購(gòu)于武漢博士德生物技術(shù)有限公司；Superscript Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(FSK-100)與SYBR Green realtime PCR master mix-plus (QPK212 plus, TOYOBO公司)；抗體Actin (Sc-1616r)為美國(guó)pierce公司)；乙醚、甲醛(20090325,上海)、PBS均為分析純。方法：132只昆明種小鼠經(jīng)數(shù)字法隨機(jī)分為常溫常濕組、溫燥組和涼燥組,每組44只,分批置人工氣候箱內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng),按文獻(xiàn)綜合條件刺激造模。各組小鼠在第6天、第12天檢測(cè)以下項(xiàng)目；小鼠剖檢前4h常規(guī)禁食、禁水。檢測(cè)項(xiàng)目：一、肺組織病理學(xué)觀察1.普通病理學(xué)觀察：斷頸處死小鼠,取小鼠右肺組織(中)40±1Omg/只,常規(guī)石臘切片、HE染色與光鏡觀察。2.超微結(jié)構(gòu)觀察：各組隨機(jī)取4只小鼠經(jīng)乙醚麻醉,經(jīng)氣管插管向肺內(nèi)注入2%戊二醛1.0 ml固定1h后,取左肺中葉組織制成1cm × 1cm × 2cm組織塊,常規(guī)切片、醋酸鈾染色與透射電鏡拍片；觀察肺呼吸膜、肺間質(zhì)超微結(jié)構(gòu),用JEDA 80ID圖像軟件(江蘇捷達(dá)公司)分析呼吸膜平均厚度。二、促炎細(xì)胞因子/抗炎細(xì)胞因子水平檢測(cè)各組經(jīng)常規(guī)氣管插管法取支氣管肺灌洗液1.5 ml、置-82℃保存、7天內(nèi)統(tǒng)一檢測(cè)。用單克隆抗體ELISA試劑盒,按說(shuō)明書操作,設(shè)空白對(duì)照、PBS陰性對(duì)照；BioTek酶免疫分析儀495 nm測(cè)定OD值,查標(biāo)準(zhǔn)品曲線計(jì)算待檢標(biāo)本含量。三、分子生物學(xué)檢測(cè)(一)肺組織水通道蛋白5mRNA測(cè)定采用熒光實(shí)時(shí)PCR方法檢測(cè)。檢索NCBI(美國(guó)國(guó)家生物信息中心)查詢基因序列,0ligo6軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增模板引物(上海生工生物技術(shù)公司),上游引物：5'-GGCTGCAATCCTCTACTTCTAC-3',下游引物：5'-TTCTTCCGCTCCTCTCTATGA-3'(127bp)；內(nèi)參照基因β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)引物序列：上游引物：5'-CCGTGAAAAGATGACCCAG-3',下游引物：5'-TAGCCACGCTCGGTCAGG-3'(191bp)。 RT-PCR反應(yīng)體系為50u1：目的cDNA4u1、Taq DNA聚合物2ul (1u/1ul)、12.5pmol的引物a、b各2ul、4×10nM dNTP 2u1;經(jīng)95℃預(yù)變性、55℃退火、72℃延伸等40個(gè)循環(huán)。采用2-△△Ct方法計(jì)算AQP5 mRNA表達(dá)水平。(二)肺組織水通道蛋白5蛋白質(zhì)表達(dá)水平檢測(cè)常規(guī)Western blotting方法檢測(cè)。主要操作步驟：提取總蛋白、BCA(bicinchoninic acid)法測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)含量、SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫反應(yīng)、化學(xué)發(fā)光,顯影,定影、膠片掃描,alphaEaseFc圖像分析軟件進(jìn)行密度分析并計(jì)算灰度值,所得結(jié)果為目的蛋白的相對(duì)含量。四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,顯著性檢驗(yàn)采用多個(gè)樣本均數(shù)間q檢驗(yàn)(Newman-Keuls法)：P0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)a=0.05。結(jié)果：一、組織病理學(xué)觀察(一)普通組織病理學(xué)觀察再次顯示,與常溫常濕組第6、第12天肺組織結(jié)構(gòu)無(wú)異常比較,溫燥組、涼燥組肺泡片狀瘀血、水腫與纖維素性滲出物,肺間質(zhì)增厚與炎性細(xì)胞侵潤(rùn),伴肺氣腫現(xiàn)象,均以第12天為重。(二)超微結(jié)構(gòu)觀察1、常溫常濕組第6、第12天肺呼吸膜清晰,毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰；Ⅱ型肺泡細(xì)胞(AT ⅡI)與Ⅰ型肺泡細(xì)胞(AT Ⅰ)連接清晰,AT Ⅱ微絨毛豐富且規(guī)則排列于胞膜肺泡緣處；胞內(nèi)嗜鋨性板層小體(OMB)較多且分泌旺盛；線粒體數(shù)量豐富。溫燥組、涼燥組AT ⅡI微絨毛減少,胞內(nèi)線粒體數(shù)量減少,并多見腫脹為“條狀面包狀”線粒體；肺泡隔部增寬、呼吸膜增厚、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹。2、常溫常濕組第6天、第12天肺泡隔、AT Ⅰ與AT Ⅱ結(jié)構(gòu)清晰,肺泡毛細(xì)血管與呼吸膜結(jié)構(gòu)無(wú)異常,毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)清晰無(wú)腫脹；溫燥組、涼燥組肺泡隔增寬伴膠原纖維增生,肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹,AT Ⅰ基膜腫脹、多不規(guī)則且多見點(diǎn)狀斷裂,AT Ⅰ基膜與毛細(xì)血管基膜組織間隙明顯增寬。圖像分析溫燥組、涼燥組呼吸膜較常溫常濕組明顯增厚(p0.05)。二、氣管肺泡灌洗液中促炎細(xì)胞因子/抗炎細(xì)胞因子水平1.與常溫常濕組NE與al-AT比較,溫燥組與涼燥組第6、第12天NE升高,以涼燥組為重(p0.05)；兩組al-AT下降,也以涼燥組為甚(p0.05)。2.常溫常濕組TNF-a與IL-10,溫燥組第12天、涼燥組第6與第12天TNF-a下降但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；溫燥組、涼燥組第6、第12天IL-10含量下降(p0.01)。3.與常溫常濕組ET與PAF比較,溫燥組第6、第12天ET升高但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,涼燥組則變化不明顯。溫燥組、涼燥組第6、第12天PAF升高(p0.05)。三、AQP5 mRNA與蛋白質(zhì)表達(dá)水平測(cè)定與常溫常濕組比較,溫燥組、涼燥組第6、第12天AQP5 m RNA表達(dá)下調(diào)(p0.01),以第12天為重(p0.01)；溫燥組第6、第12天AQP5蛋白質(zhì)表達(dá)水平持續(xù)下降,涼燥組則是先升后降(p0.01)。討論：1.超微結(jié)構(gòu)顯示外燥損傷呼吸膜的病理特征是：AT Ⅰ基膜腫脹且不規(guī)則、毛細(xì)血管基底膜增厚與內(nèi)皮細(xì)胞腫脹且部分呈剝脫狀性呼吸膜增厚。首次圖像量化分析顯示溫燥組、涼燥組呼吸膜較常溫常濕組顯著增厚(p0.05)。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道的外燥致AT Ⅱ線粒體腫脹表明AT Ⅱ能量代謝障礙、嗜鋨板層小體減少提示ATⅡ合成肺表面活性物質(zhì)的功能受損,而外燥致肺泡內(nèi)壁水分子層的減少可影響表面活性物質(zhì)在其上形成穩(wěn)定的單分子磷脂層膜而致肺失濡養(yǎng),必失有效調(diào)節(jié)肺泡表面張力之功并致肺泡通氣功能障礙,提出呼吸膜增厚是外燥傷肺的特征性超微組織病理學(xué)基礎(chǔ)和超微病理學(xué)指標(biāo)。2.外燥引起AT Ⅱ合成與分泌肺泡表面活性物質(zhì)減少,導(dǎo)致肺失濡潤(rùn)性肺泡超微結(jié)構(gòu)受損后的某些成分作為“內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)”(Damage associated molecular patern, DAMP)激活單核／巨噬細(xì)胞肺內(nèi)聚集并大量釋放促炎細(xì)胞因子,導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子／抗炎細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)平衡紊亂,啟動(dòng)以中性粒細(xì)胞釋放蛋白酶和血小板活化因子為中心的失控性細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng),是外燥傷肺病機(jī)的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。3.促炎／抗炎細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡引起AQP5基因表達(dá)下調(diào)及蛋白質(zhì)水平下降提示肺泡液轉(zhuǎn)運(yùn)障礙；失控性炎癥反應(yīng)引起炎性介質(zhì)瘀滯、肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、血管通透性增高與液體滲出導(dǎo)致基膜組織間隙水腫性呼吸膜增厚,重則肺泡瘀血、水腫,導(dǎo)致O2和CO2的擴(kuò)散速率和有效通氣／血液比值下降而損“肺通天氣”之功,成為解析外燥傷肺、氣逆、喘咳諸癥的病理生理學(xué)基礎(chǔ)。4.結(jié)果顯示外燥傷肺不同于“以TNF-a為主的炎性細(xì)胞因子‘瀑布效應(yīng)’損傷肺絡(luò)而致喘咳諸癥的病理學(xué)基礎(chǔ)”的報(bào)道,表明與外燥病邪致病特征相關(guān)。學(xué)位課題研究的創(chuàng)新點(diǎn)：1、首次提出Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞基膜腫脹、肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹與血管通透性增高及液體滲出導(dǎo)致基膜組織間隙水腫性呼吸膜增厚,是外燥傷肺的特征性超微組織病理學(xué)基礎(chǔ)。2、首次提出以肺毛細(xì)血管為中心拍攝呼吸膜薄側(cè)以量化測(cè)定呼吸膜平均厚度的方法。3、首次提出外燥引起AT Ⅱ合成與分泌肺泡表面活性物質(zhì)減少,導(dǎo)致肺失濡潤(rùn)與肺泡超微結(jié)構(gòu)受損后的某些成分作為“內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)”大量激活單核／巨噬細(xì)胞,引起促炎／抗炎細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡,且下調(diào)肺水通道蛋白5基因表達(dá)與蛋白質(zhì)水平,啟動(dòng)以中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶和血小板活化因子為中心的失控性炎性細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng),通過肺泡水液轉(zhuǎn)運(yùn)失調(diào)、肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、基膜組織間隙水腫等導(dǎo)致呼吸膜增厚而損“肺通天氣”之功。提出促炎／抗炎細(xì)胞因子失衡與AQP5基因表達(dá)紊亂可作為解析外燥傷肺病機(jī)的分子病理生理學(xué)基礎(chǔ)和特征性指標(biāo)之一；豐富了外燥傷肺理論,具有理論創(chuàng)新與臨床指導(dǎo)意義。
【關(guān)鍵詞】：外燥 呼吸膜 細(xì)胞因子 水通道蛋白5基因
【學(xué)位授予單位】：長(zhǎng)江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R254.4
【目錄】：

• 摘要4-9
• abstract9-16
• 縮寫詞表16-19
• 第1章 燥邪基礎(chǔ)理論探析19-25
• 1.1 外燥病變特點(diǎn)與臨床辨治19
• 1.2 細(xì)胞因子與呼吸膜損傷的相關(guān)研究概況19-23
• 1.3 水通道蛋白表達(dá)異常與肺部損傷23
• 1.4 相關(guān)研究的啟示與提出科研假說(shuō)23-24
• 1.5 研究的主要內(nèi)容與意義24-25
• 第2章 外燥小鼠呼吸膜超微結(jié)構(gòu)觀察25-29
• 2.1 主要材料25
• 2.2 方法25-27
• 2.3 結(jié)果27-29
• 第3章 外燥對(duì)小鼠氣道液細(xì)胞因子的影響29-33
• 3.1 主要材料29
• 3.2 方法29-30
• 3.3 結(jié)果30-33
• 第4章 外燥對(duì)肺組AQP5基因與蛋白質(zhì)表達(dá)的影響33-38
• 4.1 主要材料33
• 4.2 方法33-37
• 4.3 結(jié)果37-38
• 第5章 討論38-45
• 5.1 呼吸膜厚度測(cè)定方法的研究38-39
• 5.2 外燥對(duì)呼吸膜超微結(jié)構(gòu)的影響與特征39-40
• 5.3 細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡與外燥傷肺病機(jī)的相關(guān)性及意義40-43
• 5.4 學(xué)位課題研究的創(chuàng)新點(diǎn)43-44
• 5.5 對(duì)繼續(xù)研究的建議44-45
• 致謝45-46
• 參考文獻(xiàn)46-49
• 附一：呼吸膜與呼吸系統(tǒng)疾病研究進(jìn)展49-56
• 個(gè)人簡(jiǎn)介56-57
• 長(zhǎng)江大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理審查申請(qǐng)表57-58

【共引文獻(xiàn)】

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中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前4條

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本文編號(hào)：306476