【摘要】：目的:探討如何利用多種生物制劑參與的三維PCL支架誘導(dǎo)人工骨髓模型建立與評價。材料與方法:一、確認新型萘醌類化合物對Wnt/β-Catenin/TCF信號通路的影響首先對結(jié)腸癌HCT116細胞和SW480細胞進行培養(yǎng),在兩種細胞中分別添加5μM濃度的41種萘醌類化合物,進行細胞生長抑制實驗,初篩出具有較高細胞抑制作用的化合物,再次將這些化合物從低到高多種濃度進行細胞生長抑制實驗和克隆形成實驗,根據(jù)兩種實驗結(jié)果計算出各個化合物的IC_(50)值,根據(jù)實驗結(jié)果的IC_(50)數(shù)值篩選出最具潛力化合物。然后進行TOP/FOP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、擴增、提取并轉(zhuǎn)染到HCT116細胞和SW480細胞中對篩選出的化合物進行熒光素酶報告基因?qū)嶒?得到抑制Wnt/β-Catenin通路最強的化合物。Co MFA分析,以最低能量的化合物23的構(gòu)象進行構(gòu)象搜索,并以此作為模板建立其他類似物以確定分子定量結(jié)合和活性的關(guān)系。經(jīng)上述實驗篩選,對最有價值的化合物在正常細胞中進行細胞毒性測試,根據(jù)結(jié)果將最有潛力化合物應(yīng)用到整個實驗的第二部分中。二、生物修飾PCL生物支架誘導(dǎo)異位骨髓形成及影響1)首先將MDA-MB-231/GFP細胞復(fù)蘇、培養(yǎng)。MDA-MB-231/GFP細胞傳代后鋪設(shè)到含有PCL生物支架的96孔板中,48小時后顯微鏡下觀察以確定該PCL支架適宜細胞生長。2)在或不在含有10 ng/m L的rh BMP-2的ATDC5細胞中分別添加Stem Regenin-1(SR1)、淫羊藿苷和萘醌類化合物N27。72小時后進行ALP活性測試,確定在ATDC5細胞中添加不同生物制劑后對ALP活性的影響。3)在小鼠腹部皮下埋置添加不同生物制劑的PCL支架,根據(jù)PCL支架上添加物質(zhì)不同分為7組,分別為第一組(空白對照組):僅在PCL支架上添加PBS/0.1%BSA/0.1%DMSO;第二組:PCL支架上添加10μg的rh BMP-2;第三組:PCL支架上添加10μL Matrigel+10μg的rh BMP-2;第四組:PCL支架上添加2mg HA+10μL Matrigel+10μg的rh BMP-2;第五組:PCL支架上添加20μg SR1+2mg HA+10μL Matrigel+10μg的rh BMP-2;第六組:PCL支架上添加40μg淫羊藿苷+2mg HA+10μL Matrigel+10μg的rh BMP-2;第七組:PCL支架上添加40μg N27+2mg HA+10μL Matrigel+10μg的rh BMP-2。4)小鼠術(shù)后皮下埋置支架八周之后,對小鼠麻醉進行活體Micro-CT測量,確定小鼠皮下小骨形成情況。5)小鼠安樂死后取出小骨固定、脫鈣、切片,進行HE染色和masson三色染色確定各組小骨內(nèi)組織結(jié)構(gòu)和細胞組成,并進行比較分析。6)從小鼠體內(nèi)取出小骨后,反復(fù)沖洗小骨收集小骨內(nèi)細胞,進行造血集落形成實驗,確定新生小骨中造血祖細胞和造血前體細胞的頻數(shù)。7)收集小骨內(nèi)細胞,利用抗Sca-1-FITC抗體在流式細胞檢測Sca-1+的細胞,確定小骨中存在HSCs。結(jié)果:一、確認新型萘醌類化合物對Wnt/β-Catenin/TCF信號通路的影響。1.篩選有效抑制結(jié)腸癌細胞的化合物41種化合物濃度在5μM時對兩種細胞生長抑制百分比,篩選出所有化合物中具有較高細胞生長抑制作用(抑制率50%),進而測試它們IC_(50)值,其中化合物23和化合物27帶有磺酰胺結(jié)構(gòu)具有較低IC_(50)值(2μM),對HCT116細胞和SW480細胞生長具有較強抑制作用。而磺酰胺衍生物化合物24和25對SW480細胞株選擇性抑制。2.代表性化合物在β-Catenin/TCF信號通路中的生物學(xué)特征篩選出的這六個化合物4、27、31和23-25,分別測定它們在SW480和HCT116細胞熒光素酶活性的抑制作用,磺酰胺化合物27表現(xiàn)出的最有力的抑制作用。它的IC_(50)值在SW480和HCT116細胞中分別為2.1μM和2.5μM。3.代表性的化合物在β-catenin高表達的結(jié)腸癌細胞中抑制集落形成的實驗結(jié)果六種化合物(4,23,24,25,27,31)以劑量依賴的方式顯著抑制集落形成,所有化合物的IC_(50)值均小于2μM(表2,圖2)。其中磺酰胺結(jié)構(gòu)的化合物23和27是最有效,結(jié)果顯示化合物23和27的IC_(50)值在SW480細胞中分別為346n M和343n M,它們在HCT116細胞中IC_(50)值分別為390n M和348n M。4.Co MFA分析生物活性和Co MFA分析相結(jié)合展現(xiàn)了這些化合物初步結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系(見表1,2和圖3)。(1)立體輪廓顯示的主要地區(qū)(綠色)圍繞2-胺類生物活性的貢獻。二取代2-胺類(化合物4和32)比單取代的更有潛力(化合物3)。(2)不利的Co MFA區(qū)域(黃色)顯示立體位阻效應(yīng)導(dǎo)致生物活性降低(例如化合物11和12)。(3)藍色的輪廓(正電性取代基分布)被分配到磺酰胺芳環(huán)附近,如果磺酰胺被攜帶π電子的芳香環(huán)所取代,活性可以增強(例如化合物22 vs 23-25)。(4)以萘醌為核3-氯類更具有抑制作用,3-氫類取代導(dǎo)致失去活性(23 vs 30,4 vs 29)。5.正常ATDC5細胞毒性實驗ATDC5細胞株是小鼠成軟骨細胞系,化合物23在藥物濃度分別為5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM和0.3125μM時ATDC5的相對活力分別為2.85±1.49%、16.36±10.9%、89.13±3.59%、95.15±1.98%以及95.36±6.14%。化合物27在同樣藥物濃度時ATDC5的相對活力分別79.34±2.67%、85.57±2.55%、96.45±4.18%、98.35±1.33%以及99.37±0.53%。由此可見化合物27對正常細胞的毒性更小。二、生物修飾PCL生物支架誘導(dǎo)異位骨髓形成及影響。1.鑒定PCL生物支架適合細胞生長48小時后倒置顯微鏡下觀察MDA-MB-231/GFP細胞在PCL支架上的生長情況�？梢娊^大部分細胞貼壁生長,形態(tài)呈較均一的梭形(見圖4、圖5)。2.ALP活性實驗與rh BMP-2組比較,SR1+rh BMP-2組升高,P0.05。N27組和N27+rh BMP-2組比值則遠遠低于rh BMP-2組,P0.05。與SR1+rh BMP-2組比較,其他各組比值均低于SR1+rh BMP-2組,有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05。單純SR1組、Icariin組和N27組間比較,P0.05,組間無顯著差異。與N27+rh BMP-2組比較,SR1+rh BMP-2組、Icariin+rh BMP-2(即添加rh BMP-2的各組間比較),差異性顯著,P0.05(見表3和附圖6)。3.Micro-CT檢測與空白對照組(Group1)比較,其他六組骨質(zhì)密度均明顯升高,P0.05。柱狀圖可見第五組增高最明顯,當各組與第五組進行比較,差異性顯著,P0.05。但是各組骨質(zhì)含量沒能達到小鼠脊柱水平,各組與小鼠脊柱密度比較時均有顯著性差異,P0.05(見表4和附圖8)。4.組織學(xué)染色圖9A-G是第一組至第七組脫鈣后HE染色結(jié)果,空白對照組(Goup1)沒有新骨形成,肉眼觀測各組間形成新骨有差別,其中在PCL支架上添加SR1+HA+Matrigel+rh BMP-2(即group5)形成較多新骨,其形態(tài)與PCL支架形狀相似,并成包裹樣結(jié)構(gòu),圖10是第五組masson染色結(jié)果,圖9和圖10的Scale bars:500μm。圖11A-C是HE染色結(jié)果,圖11A是空白對照組(group1),圖中可見紅細胞、增生性間充質(zhì)細胞以及較多血管,Scale bars:50μm。圖11B-C是第五組染色結(jié)果,可見新形成的骨和各系造血細胞,其中包括巨核細胞、單核細胞、粒細胞和成熟紅細胞,Scale bars:20μm。5.造血集落形成除小鼠本身骨髓標本形成各類集落最多以外,第5組位居第二。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)在CFU-GEMM中,各組與第5組比較,第5組形成CFU-GEMM數(shù)量明顯高于其他各組,P0.05。在BFU-E中,各組與第5組比較,組2、組3、組4和組7明顯低于第5組,P0.05。在CFU-GM中,各組與第5組比較,組2、組3和組7明顯低于第5組,P0.05。在CFU-E中,與第5組比較,組5形成CFU-GEMM明顯高于其他各組,P0.05(見表5和附圖13)。圖13A-D是集落形成過程中形成的不同集落,其中圖13A是CFU-GEMM,可見在中心一簇紅細胞的周圍圍繞著粒細胞和巨噬細胞,中心團簇由于含有較多血紅蛋白化有核紅細胞,中心區(qū)域呈現(xiàn)紅色。圖13B由多個BFU-E組成,同時也因為團簇中較高的血紅蛋白化,團簇多呈紅色。圖13C是一簇CFU-GM,細胞密集的中心團簇周圍散在一些細胞,里面包含了粒細胞和單核細胞/巨噬細胞。和粒細胞相比,單核細胞/巨核細胞更大也形態(tài)上更不規(guī)則。圖13D是CFU-E(×10)。6.流式細胞檢測對第1組和第5組形成的小骨進行流式細胞分析,并和小鼠骨髓進行對照,比較發(fā)現(xiàn):group5 vs group1:12.6%vs 0.23%,P0.01;group5 vs FBM:12.6%±0.94%vs10.2%±1.21%,P0.05(附圖14)。結(jié)論:1.多種生物制劑修飾PCL支架可以誘導(dǎo)異位骨/骨髓形成,新型異位骨髓具有類真實骨髓的造血功能。2.在PCL支架上rh BMP-2、HA、matrigel基質(zhì)膠和SR1組合可形成更接近小鼠脊柱骨密度的骨質(zhì)同時具有較高造血功能的類真實骨髓的人工骨髓模型。3.在結(jié)腸癌細胞中對41種萘醌類新合成的萘醌類化合物進行篩選得到具有低細胞毒性和在Wnt/β-Catenin通路上較高抑制作用的抑制劑N27,該化合物在構(gòu)建人工骨髓模型中有明顯抑制骨/骨髓形成的作用。4.淫羊藿苷與其他生物制劑組合在PCL支架上形成的骨/骨髓結(jié)構(gòu)和功能僅次于SR1與其他制劑組合。5.通過本研究創(chuàng)建的三維人造骨髓模型相比其他研究技術(shù)難度低、操作簡單、重復(fù)性高、易于普及,為進一步的臨床和基礎(chǔ)研究提供新途徑,更為研究普及化打下堅實基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R-332;R318.1
【圖文】：

- 28 -圖2是六種化合物不同濃度在SW480細胞中對集落細胞形成胞中集落形成與六種化合物劑量依賴的抑制曲線。SW480細胞列藥物的濃度并孵育37°C恒溫箱，7天后進行評估。相對克隆數(shù)（未添加藥物）}x100%。結(jié)果為三個獨立的實驗進行重復(fù)，在6孔板圖（B）中展示的是最有潛力的化合物23（上板）和化合物27的直觀照片。這兩個化合物以劑量依賴方式減少集落細胞形成制的濃度≥1.25μM。

中（A）代表CoMFA等高線圖，（B）代表19個候選化合物的疊加圖

ALP AssayrhBMP-2SR1SR1+rhBMP-2ICARIINICARIIN+rhBMP-2N27N27+rhBMP-20.00.51.01.52.02.5FoldhCangeinALPActivityIcariin 為淫羊藿苷，與 SR1+ rhBMP-2 組比較，組，P<0.05。實驗結(jié)果為 3 次獨立實驗檢測結(jié)果。附圖 7：Micro-CT 影像及小骨直觀圖

【參考文獻】

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本文編號：2795084