發(fā)布時(shí)間：2020-07-06 23:36

【摘要】：目的:研究血管生成素-2(Angiopoietin-2)在下肢缺血模型的實(shí)驗(yàn)小鼠中,對(duì)缺血部位血管生成的作用機(jī)制。方法:1.建立C57/B L6小鼠下肢缺血模型及腹腔給藥:麻醉實(shí)驗(yàn)小鼠后,經(jīng)股深動(dòng)脈下緣和乆動(dòng)脈上緣結(jié)扎實(shí)驗(yàn)小鼠左側(cè)股動(dòng)脈干支,并且離斷雙結(jié)之間股動(dòng)脈干支,縫合皮膚,復(fù)溫后,應(yīng)用激光多普勒儀記錄實(shí)驗(yàn)小鼠雙下肢血流灌注情況,在結(jié)扎前(pre),1d,3d,5d,8d,各記錄一次血流情況。計(jì)算左腿與右腿的血流比值,即結(jié)扎側(cè)與非結(jié)扎側(cè)的比值。將實(shí)驗(yàn)小鼠分為兩組,對(duì)照組和給藥組,各組為3只實(shí)驗(yàn)小鼠,對(duì)照組經(jīng)腹腔注射給予等量的生理鹽水,給藥組腹腔注射重組人血管生成素-2(recombination-human-Ang-2),在結(jié)扎日(1d),3d,5d,各給藥一次。在第8d處死實(shí)驗(yàn)小鼠,經(jīng)下腔靜脈取抗凝血,離心,取上清液;取雙側(cè)下肢肌肉,包括內(nèi)收肌和腓腸肌。2.ELISA法檢測(cè)血清中rh-Ang-2的含量:取實(shí)驗(yàn)小鼠離心后的血清,按ELISA試劑盒操作說(shuō)明檢測(cè)血清中rh-Ang-2的含量。3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析待測(cè)組織樣品中目的基因的表達(dá):用液氮研磨實(shí)驗(yàn)小鼠肌肉組織,用t rizol裂解研碎的組織,傳統(tǒng)法抽提總RNA,瓊脂糖凝膠電泳分析所提RNA質(zhì)量,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀分析目的基因的表達(dá),包括Ang-1,Ang-2,PDGF-BB,PDGFR-β,VEGF-A,VEGF-C。4.應(yīng)用免疫熒光法分析小鼠肌肉血管生成情況:取小鼠下肢肌肉,以4%多聚甲醛固定,送病理科以石蠟包埋,并制成病理切片,用anti-α-sma做免疫熒光分析,靶向標(biāo)記血管周細(xì)胞,計(jì)算新生血管的平均管徑。5.體外血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)研究ang-2對(duì)pdgf-bb信號(hào)通路的影響:用培養(yǎng)皿培養(yǎng)人臍靜脈血管平滑肌細(xì)胞(huvsmc),設(shè)置4各組,分別為空白組(control),ang-2組,pdgf-bb組,ang-2+pdgf-bb組,在無(wú)血清培養(yǎng)基情況下,在各組中加入對(duì)應(yīng)處理因素,分別做了細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)。6.統(tǒng)計(jì)方法:采用spss17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,p0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1.ang-2對(duì)下肢缺血小鼠模型血流灌注恢復(fù)情況的影響:對(duì)照組實(shí)驗(yàn)小鼠內(nèi)收肌血流自結(jié)扎日起,血流逐漸增大,而ang-2組血流增加不明顯;而相比腓腸肌血流變化,對(duì)照組與ang-2組無(wú)明顯差異。2.血清e(cuò)lisa結(jié)果顯示,對(duì)照組血清rh-ang-2未檢出,ang-2組血清中檢出rh-ang-2。3.實(shí)時(shí)熒光定量pcr結(jié)果顯示,ang-2組實(shí)驗(yàn)小鼠缺血測(cè)內(nèi)收肌中,促血管生長(zhǎng)因子ang-1,ang-2,pdgf-bb,vegf-a,vegf-c的表達(dá)量下降。4.免疫熒光顯示ang-2組實(shí)驗(yàn)小鼠下肢缺血測(cè)內(nèi)收肌平均血管管徑小于對(duì)照組。5.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示,pdgf-bb組劃痕距離恢復(fù)最快,ang-2+pdgf-bb次之,ang-2最慢,ang-2阻止pdgf-bb誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞遷移;蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)顯示,ang-2+pdgf-bb組中pdgfr-β受體的磷酸化被抑制,表明ang-2阻止pdgf-bb增加的pdgfr-β受體的磷酸化。結(jié)論:1.ang-2減少下肢缺血灌注,抑制內(nèi)收肌血管的生成與成熟,對(duì)腓腸肌血管新生的影響不明顯。2.rh-Ang-2不存在于對(duì)照組小鼠中,而存在于給藥組實(shí)驗(yàn)小鼠血清中,并影響其血管生成。3.Ang-2下調(diào)了內(nèi)收肌血管生成中促血管因子Ang-1,Ang-2,PDGF-BB,VEGF-A,VEGF-C的表達(dá)。4.Ang-2抑制缺血測(cè)內(nèi)收肌平均血管管徑的增大。5.Ang-2減弱或者抑制了P DGF-BB/PDGFR-β信號(hào)通路。
【學(xué)位授予單位】：四川醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R965
【圖文】：

圖 2. Ang-2 減少小鼠下肢血流灌注：在一周時(shí)間內(nèi)，C57/BL6 小鼠下肢缺血模型，激光多普勒掃描顯示 Ang-2 減少小鼠內(nèi)收肌肉血流灌注，但對(duì)腓腸肌影響不大。A，代表性的小鼠內(nèi)收肌血流變化圖。B,小鼠內(nèi)收肌血流恢復(fù)比較，*P<0.05，n=3/組。C，代表性的小鼠腓腸肌血流變化圖。D，小鼠腓腸肌血流恢復(fù)比較。Fig2. Ang-2 reduces blood flow perfusion in a mouse hindlimb ischemia model. in a week time, Ang - 2 reduces blood flow perfusion inischemic adduction muscles, but not gastrocnemius muscles followed Color Laser Doppler Scanner. A . Representative images ofadductor muscle blood flow changes in mice. B. The curve of blood flow recovery of ischemic adductor muscles, * P < 0.05 Vs. vehicle,n=3/group. C. Representative images of the gastrocnemius muscle in mice blood flow changes. D. The curve of blood flow recovery ofischemic gastrocnemius muscles.2. 血清 ELISA 結(jié)果按照 human-Ang-2 ELISA 試劑盒的操作說(shuō)明，檢測(cè)兩組小鼠血漿中 rh-Ang-2 的含量。其中，對(duì)照組未檢測(cè)出 rh-Ang-2，Ang-2組 3 個(gè)小鼠均檢測(cè)出 rh-Ang-2，其含量分別為 89.908pg/ml，

四川醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文 3. 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 擴(kuò)增效果及分析目的基因 Ang-1，Ang-2，Tie2，VEGF-A，VEGF-C，PDGF-B 和參基因 GAPDH 的擴(kuò)增曲線表明，目的產(chǎn)物均得到了充分的擴(kuò)增。在實(shí)驗(yàn)研究中，目的基因 Ang-1，Ang-2，Tie2，VEGF-A，VEGF-C，PDGF和內(nèi)參基因 GAPDH 的溶解曲線和擴(kuò)增曲線均符合實(shí)驗(yàn)要求（見圖 到圖 9B）。

四川醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文 3. 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 擴(kuò)增效果及分析目的基因 Ang-1，Ang-2，Tie2，VEGF-A，VEGF-C，PDGF-B 和參基因 GAPDH 的擴(kuò)增曲線表明，目的產(chǎn)物均得到了充分的擴(kuò)增。在實(shí)驗(yàn)研究中，目的基因 Ang-1，Ang-2，Tie2，VEGF-A，VEGF-C，PDGF和內(nèi)參基因 GAPDH 的溶解曲線和擴(kuò)增曲線均符合實(shí)驗(yàn)要求（見圖 到圖 9B）。

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本文編號(hào)：2744299