本文關(guān)鍵詞：miRNA-126與大鼠DVT血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的相關(guān)性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：[目的]深靜脈血栓(DVT)是骨科手術(shù)常見(jiàn)并發(fā)癥,常導(dǎo)致嚴(yán)重后果,其機(jī)制復(fù)雜,需繼續(xù)深入探索。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)凋亡在DVT的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用,而這一過(guò)程可能與microRNAs相關(guān)。研究表明microRNAs廣泛參與調(diào)控細(xì)胞分化、增殖、凋亡等生理及病理生理過(guò)程,且miR-126是與VEC及血管功能密切相關(guān)的microRNA,提示miR-126可能參與了VEC凋亡的調(diào)控。此外,研究還顯示,Bcl-2, Bad表達(dá)在不同組織及細(xì)胞凋亡的過(guò)程中存在差異性表達(dá)。因此,本實(shí)驗(yàn)在構(gòu)建miR-126基因沉默/高表達(dá)的大鼠DVT模型后,采用HE染色、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試驗(yàn)來(lái)觀察miR-126表達(dá)變化對(duì)DVT形成及內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。并通過(guò)Western bolt分析Bcl-2, Bad表達(dá)在不同組中的表達(dá)變化,探尋miR-126與DVT靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及Bcl-2, Bad的相關(guān)性,為DVT防治新方法提供理論依據(jù)和新靶點(diǎn)。[材料和方法]1.分組及造模：將72只SD大鼠(250±20g),雌雄各半、年齡不限,隨機(jī)分為4組。A、正常對(duì)照組(12只)：給予腹腔注射20ml生理鹽水,不進(jìn)行其他處理。B、DVT模型組(20只)：給予腹腔注射20ml生理鹽水,四天后腹腔麻醉,腹正中線逐層開(kāi)腹,分離暴露下腔靜脈,5-0愛(ài)惜康縫合線沿下腔靜脈平行、緊貼放置,再用4-0愛(ài)惜康縫合線結(jié)扎此處下腔靜脈,再抽去并排的5-0愛(ài)惜康縫合線,關(guān)腹,正常飼養(yǎng)；C、miRNA-126沉默組(20只)：給予腹腔注射含400pmol antagomir的轉(zhuǎn)染化合物20ml,構(gòu)建miR-126基因沉默的大鼠模型,四天后處理同DVT模型組；D、miRNA-126高表達(dá)組(20只)：給予腹腔注射含400pmol agomir的轉(zhuǎn)染化合物20ml,構(gòu)建miR-126基因高表達(dá)的大鼠模型,四天后處理同DVT模型組；2、靜脈壁采集及病理檢查根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,分別于造模后2h、24h隨機(jī)抽取正常組、DVT模型組、miRNA-126沉默組、miRNA-126高表達(dá)組大鼠各半數(shù),經(jīng)麻醉消毒后開(kāi)腹切取結(jié)扎線至髂總靜脈分叉處之間2cm長(zhǎng)的下腔靜脈及其內(nèi)容物,肉眼下觀察是否有血栓形成,并將部分新鮮組織以4%多聚甲醛固定后送石蠟切片觀察血栓形成狀態(tài),其余部分經(jīng)生理鹽水沖洗,去掉管內(nèi)外血栓后迅速放人凍存管,置入液氨罐保存。3、采用TUNEL染色觀察靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡情況從液氨罐中取出不同時(shí)間點(diǎn)位各組分組織快速作石蠟切片,并按照TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(上海翊圣)說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡發(fā)生情況,經(jīng)DAPI復(fù)染后在熒光顯微鏡下觀察及拍攝。4、Western bolt檢測(cè)SD大鼠DVT靜脈壁組織中Bcl-2, Bad的蛋白表達(dá)變化A、使用組織裂解液對(duì)不同時(shí)間位點(diǎn)保存于液氮中的各組靜脈壁材料進(jìn)行總蛋白的提取并用BCA法測(cè)定總蛋白濃度。B、制備SDS-PAGE電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育等操作；以ChemiScop Series3600化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)拍照顯示結(jié)果,并用Chemi Analysis分析計(jì)算灰度值。C、選用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,各組數(shù)值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA);各組結(jié)果以P0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。[結(jié)果]1、肉眼觀察血栓形成情況2h位點(diǎn),大鼠DVT組、沉默組及高表達(dá)組肉眼觀可見(jiàn)有靜脈管壁水腫,顏色加深,未見(jiàn)明顯血栓形成；在24h位點(diǎn),除正常組外,其余三組靜脈管壁明顯水腫,下腔靜脈明顯腫脹及青紫,內(nèi)有大量血栓形成,并以DVT模型組及miRNA-126沉默組最明顯。2、HE染色觀察血栓形成情況2h位點(diǎn),各組大鼠HE染色無(wú)明顯血栓形成,但DVT模型組及miRNA-126沉默可見(jiàn)多量紅細(xì)胞集聚,在24h時(shí)可見(jiàn)DVT組及miRNA-126沉默組完全血栓形成,miRNA-126高表達(dá)組不完全性血栓形成。3、Tunel凋亡實(shí)驗(yàn)在不同時(shí)間位點(diǎn),通過(guò)觀察熒光密度(即細(xì)胞凋亡程度)判斷細(xì)胞凋亡情況；在2h時(shí),miR-126沉默組內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞凋亡情況較DVT模型組重,而正常組及miR-126高表達(dá)組未看到明顯細(xì)胞凋亡；至24h,除正常組外均可見(jiàn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡發(fā)生。與DVT模型組相比,miR-126沉默組凋亡程度重,miR-126過(guò)表達(dá)組,細(xì)胞凋亡程度較輕。4、Western bolt檢測(cè)Bcl-2, Bad蛋白與正常組相比,各組Bel-2、Bad表達(dá)水平在不同時(shí)間位點(diǎn)發(fā)生了改變。結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,在2h,Bcl-2表達(dá)組內(nèi)不全相等(F=2982.881,p0.001),有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,在24h位點(diǎn),Bcl-2組內(nèi)不全相等(F=352.747,p0.001),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,在2h、24h位點(diǎn),DVT組與miRNA高表達(dá)組、miRNA沉默組與miRNA高表達(dá)組差異明顯(P0.001)；在2h位點(diǎn),Bad表達(dá)組內(nèi)不全相等(F=571.01,p0.001)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,在24h位點(diǎn),Bad組內(nèi)不全相等(F=393.684,p0.001),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,在2h、24h位點(diǎn),DVT組與miRNA高表達(dá)組、miRNA沉默組與miRNA高表達(dá)組Bad表達(dá)差異明顯(P0.001)。[結(jié)論]l、miR-126與DVT形成及靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡呈負(fù)相關(guān)2、miR-126與Bcl-2表達(dá)水平呈正相關(guān),與Bad表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)
【關(guān)鍵詞】：深靜脈血栓 內(nèi)皮細(xì)胞凋亡 miR-126 Bcl-2 Bad
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R619
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• Abstract8-12
• 中英文縮略詞表12-14
• 前言14-18
• 材料和方法18-33
• 結(jié)果33-42
• 討論42-51
• 結(jié)論51-52
• 參考文獻(xiàn)52-57
• 綜述57-63
• 參考文獻(xiàn)61-63
• 作者讀書(shū)期間基本情況63-64
• 致謝64

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本文編號(hào)：264113