本文選題：燒傷　切入點(diǎn)：谷氨酰胺　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2016年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：嚴(yán)重?zé)齻軌蛞l(fā)腸道炎癥和氧化應(yīng)激,引起腸道損傷,最終導(dǎo)致腸道屏障破壞及腸道功能紊亂。研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)應(yīng)用谷氨酰胺(Glutamine,Gln)或益生菌(probiotics)都能降低腸道炎癥和腸道損傷。已有的研究認(rèn)為谷氨酰胺能給腸道補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)并能抑制機(jī)體的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),而益生菌能夠調(diào)整腸道微生態(tài)并起到保護(hù)腸道及抑制腸道炎癥反應(yīng)的作用,但是其相關(guān)詳細(xì)機(jī)理尚未明確。聯(lián)合應(yīng)用谷氨酰胺和益生菌是否能更有效降低腸道炎癥和氧化應(yīng)激進(jìn)而更好的保護(hù)腸道,現(xiàn)無(wú)明確定論。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)重度燒傷的大鼠模型腸道中一氧化氮(NO)明顯增高,提示NO在燒傷引發(fā)腸道炎癥和氧化應(yīng)激中起重要作用。NO是重要的生理活性物質(zhì),其表達(dá)在正常情況下維持機(jī)體的生理機(jī)能。當(dāng)NO異常增高會(huì)導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的出現(xiàn)。由于谷氨酰胺、益生菌能抑制燒傷引發(fā)腸道炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng),而燒傷又能刺激腸道大量釋放NO,故我們推測(cè)谷氨酰胺或益生菌的應(yīng)用可能通過(guò)抑制腸道NO異常增高來(lái)發(fā)揮腸道保護(hù)作用,它們聯(lián)合應(yīng)用能夠增強(qiáng)彼此抗氧化應(yīng)激和抗炎癥的能力,可能更有效發(fā)揮對(duì)腸道保護(hù)的功效。因此,我們擬通過(guò)大鼠重度燙傷模型研究谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應(yīng)用對(duì)腸道的保護(hù)作用以及了解聯(lián)合應(yīng)用是否通過(guò)降低腸道中NO來(lái)抑制腸道炎癥和氧化應(yīng)激,并深入闡明其相關(guān)機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重?zé)齻芗せ钅c道大量合成NO,并引起腸道爆發(fā)氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng),導(dǎo)致腸道損傷。不僅如此我們還發(fā)現(xiàn)在燒傷后氧化應(yīng)激反應(yīng)是先于炎癥反應(yīng),有效降低氧化應(yīng)激反應(yīng)就能減少機(jī)體及腸道炎癥因子的釋放。進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn),誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)通過(guò)NF-κB激活炎癥反應(yīng),而抑制iNOS能有效降低機(jī)體及腸道的炎癥反應(yīng)。燒傷通過(guò)影響了iNOS基因高度甲基化狀態(tài)導(dǎo)致iNOS異常表達(dá),谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應(yīng)用能通過(guò)增強(qiáng)iNOS基因的甲基化水平而降低NO的合成及釋放,最終抑制了燒傷引發(fā)的腸道氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。因此,iNOS在燒傷引起的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應(yīng)用可通過(guò)調(diào)控iNOS基因的甲基化而抑制腸道氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),進(jìn)而保護(hù)腸道免于炎癥引發(fā)的損傷。重度燒傷早期機(jī)體有大量體液滲出,且機(jī)體嚴(yán)重的應(yīng)激反應(yīng)使體內(nèi)血流重分布,導(dǎo)致腸道血流量顯著下降,引發(fā)腸道缺氧及營(yíng)養(yǎng)和能量的缺乏,從而誘發(fā)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)介導(dǎo)腸道損傷。腸道損傷后會(huì)發(fā)生腸上皮細(xì)胞的凋亡和壞死,導(dǎo)致腸黏膜通透性增強(qiáng),腸道內(nèi)的細(xì)菌和大分子物質(zhì)容易通過(guò)腸壁進(jìn)入血液,加重了氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),進(jìn)一步破壞腸道的機(jī)械屏障和免疫屏障,發(fā)展為全身性的感染。因此,嚴(yán)重?zé)齻哪c道保護(hù)在燒傷治療中占據(jù)重要的地位。谷氨酰胺作為腸上皮細(xì)胞的主要能源物質(zhì)在嚴(yán)重?zé)齻髸?huì)顯著減少,研究發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重?zé)齻笱a(bǔ)充谷氨酰胺能夠明顯抑制腸道的炎癥反應(yīng),維持腸道機(jī)械屏障,因而對(duì)燒傷后腸道具有強(qiáng)烈的保護(hù)作用。益生菌能調(diào)節(jié)腸道菌群,抑制有害菌的增殖,糾正腸道功能紊亂,同樣對(duì)腸道的屏障功能具有明顯的保護(hù)作用。谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應(yīng)用可能會(huì)更好的發(fā)揮對(duì)腸道的保護(hù)作用。如前所述,NO在重度燒傷動(dòng)物模型的腸道中異常合成并大量釋放,它可能是燒傷后腸道釋放的重要應(yīng)激分子及腸道損傷的主要因素。谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應(yīng)用可能通過(guò)抑制NO異常釋放進(jìn)而降低腸道損傷并保護(hù)腸道。NO是一種在胃腸道內(nèi)廣泛分布的生理活性物質(zhì),生理狀態(tài)下其參與了胃腸道的運(yùn)動(dòng)及胃腸道粘膜的保護(hù),而在燒傷、腸道炎癥等情況下,NO則參與或加重腸道炎癥反應(yīng)。NO是由一氧化氮合酶(NOS)催化L-精氨酸而生成。目前已知NOS有神經(jīng)型NOS(n NOS)、內(nèi)皮型NOS(e NOS)及誘導(dǎo)型NOS(iNOS),前兩者稱為結(jié)構(gòu)型NOS(c NOS)。c NOS合成少量NO發(fā)揮生理效應(yīng),iNOS則可產(chǎn)生的過(guò)量NO而發(fā)揮有害效應(yīng)。因此iNOS表達(dá)量是NO異常產(chǎn)生的關(guān)鍵。iNOS表達(dá)受到其DNA甲基化水平的調(diào)控,以往研究發(fā)現(xiàn)正常情況下機(jī)體中iNOS基因保持著高水平的甲基化狀態(tài)并有效阻止iNOS的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。但在機(jī)體受到刺激或嚴(yán)重?zé)齻麜r(shí)iNOS的表達(dá)出現(xiàn)異常增高。iNOS基因的甲基化水平可能發(fā)生改變,從而影響iNOS的表達(dá)。由此我們推測(cè),谷氨酰胺和益生菌保護(hù)腸道和抑制氧化應(yīng)激的作用可能是通過(guò)調(diào)控iNOS基因的甲基化狀態(tài),從而抑制燒傷引發(fā)的腸道炎癥反應(yīng)及損傷。本研究發(fā)現(xiàn)燒傷能夠刺激機(jī)體及腸道產(chǎn)生大量的NO、ROS、MDA并導(dǎo)致SOD活力降低,也能刺激機(jī)體及腸道釋放炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-8,同時(shí)減少機(jī)體中IL-4的產(chǎn)生。通過(guò)聯(lián)合應(yīng)用谷氨酰胺和益生菌能夠有效降低氧化應(yīng)激標(biāo)志物及炎癥因子的釋放,并對(duì)腸道屏障起保護(hù)作用。為明確NO是否在燒傷引發(fā)的腸道炎癥中的作用和地位,我們采用NOS抑制劑L-NAME干預(yù)處理燙傷大鼠模型。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大鼠燒傷后血液中TNF-α、IL-6增高時(shí)間比ROS、NO、MDA要晚,提示燒傷引發(fā)機(jī)體氧化應(yīng)激早于炎癥反應(yīng)。L-NAME不僅有效抑制了腸道iNOS表達(dá)和NO合成,也能明顯降低氧化應(yīng)激指標(biāo)(ROS、MDA)的水平和提高SOD活性以及減少炎癥因子(TNF-α、前言IL-6)的產(chǎn)生,從而抑制了腸道的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。聯(lián)合應(yīng)用谷氨酰胺和益生菌與應(yīng)用L-NAME抑制劑有類(lèi)似效果,說(shuō)明聯(lián)合應(yīng)用通過(guò)抑制NO合成降低了氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng),而iNOS是NO合成和釋放的關(guān)鍵因素。而與以往研究不同的是,我們還證實(shí)了iNOS是通過(guò)對(duì)NF-κB的調(diào)控進(jìn)而影響炎癥反應(yīng)。我們研究還發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應(yīng)用能夠通過(guò)提高iNOS基因的甲基化水平來(lái)抑制iNOS的表達(dá),從而減少NO的異常合成,同時(shí)其能提高PPARγ的表達(dá),從而降低了腸道炎癥和氧化損傷。總之,我們的研究不僅闡明了iNOS在燒傷引發(fā)腸道氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)中的重要作用,也初步探討了谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應(yīng)用在有效抑制iNOS表達(dá)、減少燒傷引發(fā)的腸道炎癥和損傷作用中的分子機(jī)制。研究目的1.明確嚴(yán)重?zé)齻鸬臋C(jī)體及腸道氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的相關(guān)機(jī)制及iNOS在其中發(fā)揮的作用;2.探討谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應(yīng)用治療燒傷引發(fā)的腸道損傷的藥效和機(jī)制;3.闡明燒傷所誘發(fā)iNOS在腸道中高表達(dá)的原因及探討谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應(yīng)用對(duì)iNOS表達(dá)的表觀遺傳學(xué)影響。材料和方法一、燒傷模型的建立、干預(yù)措施及取材1.雄性Wistar大鼠110只(8周齡,140g-185g),由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。分組如下(根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分成兩個(gè)大組):(1)對(duì)照組;模型組;谷氨酰胺治療組;益生菌治療組;谷氨酰胺+益生菌治療組;(2)對(duì)照組;模型組;L-NAME(NOS抑制劑)組。致傷大鼠麻醉后將背部脫毛區(qū)浸以100℃沸水15s,制成20%體表面積全層皮膚燙傷模型。對(duì)照組則在大鼠麻醉后將背部脫毛區(qū)浸于25℃溫水中15s。2.實(shí)驗(yàn)Ⅰ:對(duì)照組:1ml生理鹽水灌胃;模型組:致傷后1ml生理鹽水灌胃;谷氨酰胺治療組:致傷后谷氨酰胺(1.5g/kg)+1ml生理鹽水灌胃;益生菌治療組:致傷后益生菌(300mg/kg)+1ml生理鹽水灌胃;谷氨酰胺+益生菌治療組:致傷后谷氨酰胺(1.5g/kg)+益生菌(300mg/kg)+1ml生理鹽水灌胃。干預(yù)措施均為1次/d,連續(xù)7d。于傷后第7d,將各組大鼠麻醉并取腸管及血液樣本。3.實(shí)驗(yàn)Ⅱ:對(duì)照組及模型組致傷后即尾靜脈注射1ml生理鹽水;L-NAME組致傷后即尾靜脈注射L-NAME HCL(100mg/kg)。對(duì)照組、模型組和L-NAME組大鼠分別于傷后0、1、6,24h收集血液標(biāo)本,于傷后24h麻醉后取腸組織樣本。二、生化指標(biāo)檢測(cè)1.IL-6、IL-4、IL-8、TNF-α:酶聯(lián)免疫吸附法和熒光檢測(cè)法。2.ROS、SOD、MDA:化學(xué)發(fā)光法。3.NO:NO檢測(cè)試劑盒。三、q RT-PCR(Quantitative real-time polymerase chain reaction)檢測(cè)以各組大鼠腸管提取總RNA,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后,使用q RT-PCR技術(shù)檢測(cè)各組樣本的iNOS、e NOS、n NOS、NF-κB、Bax、EGF、IL-6、TNF-α、s ICAM-1、s VCAM-1、PPARγ、DNMT-1、Tet1及GADPH的m RNA表達(dá)水平。四、TUNNEL檢測(cè)通過(guò)TUNNEL試劑盒檢測(cè)腸道細(xì)胞凋亡情況,測(cè)100μm2凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)。五、HE檢測(cè)對(duì)各組大鼠的腸道樣本進(jìn)行HE染色,觀察各組大鼠腸道損傷情況。六、Western blot(WB)用SDS PAGE凝膠電泳分離轉(zhuǎn)移各組別腸道蛋白并將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上。脫脂奶粉封閉后分別孵以NF-κB、EGF、Bax、IKKB、PERK、ERK、P100、P52、DNMT-1、Tet1、iNOS、e NOS、n NOS、PPARγ和GAPDH抗體。在孵以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗后以ECL法檢測(cè)蛋白表達(dá)強(qiáng)度。七、甲基化特異性PCR檢測(cè)(Methylation-Specific PCR,MS-PCR)DNA甲基化狀態(tài)制備基因組DNA,DNA在亞硫酸氫鹽處理后,采用DNA甲基化檢測(cè)試劑盒用引物進(jìn)行e NOS、iNOS甲基化DNA擴(kuò)增。八、數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析采用SPSS22.0軟件。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。組間比較采用單因素方差分析,P0.05認(rèn)為存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。研究結(jié)果一、燒傷可誘發(fā)機(jī)體及腸道的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應(yīng)用能夠有效控制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的程度。采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)大鼠燙傷后血液中氧化應(yīng)激的指標(biāo),發(fā)現(xiàn)NO、ROS、MDA在燒傷后處于增高狀態(tài),且SOD的活力受到嚴(yán)重抑制。ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)血液中IL-6、TNF-α、IL-8均增高,而IL-4降低。谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應(yīng)用能夠有效降低ROS、MDA、NO、TNF-a、IL-6、IL-8在血液中的含量、增高IL-4含量并顯著提高SOD活力。腸組織的氧化應(yīng)急指標(biāo)及炎癥因子的檢測(cè)結(jié)果顯示,除IL-4無(wú)明顯變化外,其余指標(biāo)的變化與血液中的變化趨勢(shì)相同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明燒傷誘發(fā)了機(jī)體及腸道的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應(yīng)用可顯著改善機(jī)體及腸道的氧化應(yīng)激和炎癥狀態(tài)。二、燒傷后NO表達(dá)水平可影響機(jī)體及腸道的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),iNOS通過(guò)調(diào)控NF-κB而影響腸道炎癥反應(yīng)的程度。通過(guò)q RT-PCR、WB、ELISA和化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)L-NAME對(duì)燙傷大鼠氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響,并明確NO在其中發(fā)揮的作用。研究發(fā)現(xiàn)傷后血液中SOD、MDA、ROS、NO的改變要早于IL-6、TNF-α,提示燒傷引發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)要先于炎癥產(chǎn)生;傷后24h腸道NO、ROS、MDA、TNF-α、IL-6含量明顯升高,SOD明顯降低。L-NAME組腸道NO、ROS、MDA、TNF-α、IL-6含量明顯降低,SOD明顯升高。通過(guò)使用NOS抑制劑L-NAME抑制燒傷引發(fā)的NO異常合成,抑制了機(jī)體及腸道的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),證實(shí)了抑制NO可減少機(jī)體及腸道的氧化應(yīng)激標(biāo)志物和炎癥因子的產(chǎn)生;L-NAME組iNOS表達(dá)明顯降低,NF-κB P65表達(dá)隨之降低,提示iNOS通過(guò)NF-κB而調(diào)控炎癥反應(yīng)。三、谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應(yīng)用對(duì)燒傷后腸道損傷的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。病理結(jié)果顯示谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應(yīng)用能很好的修復(fù)腸道損傷,恢復(fù)腸道屏障功能。TUNNEL檢測(cè)表明聯(lián)合應(yīng)用能明顯減少腸道細(xì)胞的凋亡,WB及q RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用抑制促凋亡相關(guān)蛋白BAX在腸道中的表達(dá),而增高細(xì)胞修復(fù)相關(guān)的細(xì)胞因子EGF的表達(dá),從而減少腸道損傷并激活腸道修復(fù)。WB及q RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),聯(lián)合應(yīng)用谷氨酰胺和益生菌可有效降低腸道中iNOS的表達(dá),其通過(guò)抑制NF-κB經(jīng)典途徑而調(diào)控炎癥和保護(hù)腸道。WB及q RT-PCR檢測(cè)還發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用谷氨酰胺和益生菌能夠有效增強(qiáng)PPARγ表達(dá),從而抑制NF-κB通路。故谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應(yīng)用對(duì)調(diào)控iNOS的表達(dá)及對(duì)腸道的保護(hù)具有重要的作用。四、谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應(yīng)用可通過(guò)調(diào)控iNOS基因的甲基化水平而調(diào)控iNOS表達(dá)。MS-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),iNOS基因的DNA甲基化水平燒傷后出現(xiàn)降低,聯(lián)合應(yīng)用谷氨酰胺和益生菌能夠顯著提高iNOS基因的甲基化水平,而e NOS基因的DNA甲基化水平在燒傷和聯(lián)合應(yīng)用后均沒(méi)有明顯改變。WB及q RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),燙傷后甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMT-1)顯著降低,去甲基化酶(Tet1)顯著升高。谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應(yīng)用后,DNMT-1的表達(dá)水平提高,而Tet1的表達(dá)水平降低,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應(yīng)用能夠通過(guò)調(diào)控iNOS基因的甲基化水平而調(diào)控iNOS的表達(dá)。研究結(jié)論谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應(yīng)用能通過(guò)影響DNA甲基化酶及去甲基化酶的表達(dá),提高iNOS基因的甲基化水平,從而使NO的表達(dá)顯著降低,進(jìn)而抑制了燒傷后腸道的氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng),減少腸道細(xì)胞凋亡,改善腸道修復(fù)功能并維護(hù)腸道的屏障功能。谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應(yīng)用能增強(qiáng)PPARγ的表達(dá)進(jìn)而抑制NF-κB的表達(dá),降低了腸道炎癥反應(yīng),這可能是谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應(yīng)用有效保護(hù)腸道的重要機(jī)制�？傊�,本研究證實(shí)燒傷導(dǎo)致腸道iNOS的異常表達(dá)在燒傷引發(fā)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)中占據(jù)重要位置。谷氨酰胺和益生菌聯(lián)合應(yīng)用通過(guò)抑制燒傷后腸道iNOS的表達(dá)而發(fā)揮保護(hù)腸道的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R644

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本文編號(hào)：1603900