本文關(guān)鍵詞：嗎啡戒斷、復(fù)吸大鼠不同腦區(qū)肌動蛋白重構(gòu)及其機制研究

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【摘要】：阿片成癮是一種復(fù)雜的、復(fù)發(fā)性的腦病,主要表現(xiàn)為強迫性的覓藥行為、無法控制的用藥,以及戒斷后負(fù)性情緒狀態(tài)的產(chǎn)生。成癮者在長期戒斷后,當(dāng)再次使用藥物、遭遇應(yīng)激事件或接觸藥物濫用的相關(guān)環(huán)境時,依然會表現(xiàn)為沖動控制能力的下降、沖動行為增加,并引發(fā)復(fù)吸。長期藥物濫用導(dǎo)致的獎賞和記憶神經(jīng)環(huán)路的異常重構(gòu)被認(rèn)為是成癮行為形成的關(guān)鍵。然而,對成癮行為形成中突觸及結(jié)構(gòu)的可塑性變化尚需進(jìn)一步闡明。本實驗從骨架肌動蛋白入手,結(jié)合動物行為學(xué)、分子細(xì)胞生物學(xué)等方法,研究大鼠嗎啡戒斷和復(fù)吸形成過程中肌動蛋白重構(gòu)的變化及機制,進(jìn)一步深化對阿片類藥物成癮的分子生物學(xué)機制的認(rèn)識。第一部分嗎啡戒斷及再誘導(dǎo)大鼠不同腦區(qū)肌動蛋白重構(gòu)及其機制研究目的:研究大鼠嗎啡戒斷及再誘導(dǎo)后不同腦區(qū)肌動蛋白的變化方法:1嗎啡依賴、戒斷和嗎啡再誘導(dǎo)大鼠模型的制備:清潔級雄性SD大鼠48只,按隨機分組原則分組。N2、N4、N5和N6組采用劑量遞增法腹腔注射鹽酸嗎啡7天,以建立嗎啡依賴模型,N1組及N3組給予等體積的生理鹽水。第8-20d,停止注射。第21d,N3組和N4動物,腹腔注射10mg/kg嗎啡;N6組和N5組,先分別右側(cè)腦室注射1μL的生理鹽水和0.5μg/μL Latrunculin A,10min后,再腹腔注射10mg/kg嗎啡;N1組腹腔注射等體積生理鹽水;N2組不做處理。1.1行為學(xué)評分:第8-21d,每天觀察20min行為學(xué)變化,包括:濕狗樣顫抖、站立、伸展、清理皮毛、吞咽、齒顫、舔陰、腹瀉。第21d,所有組進(jìn)行行為學(xué)評分。所有組動物,在所有測試完成后,立馬戊巴比妥鈉麻醉,斷頭取腦,分離相關(guān)腦區(qū):海馬(Hip),前額葉皮質(zhì)(Pfc),紋狀體(Str),伏隔核(NAc)。2 Western-blot檢測腦組織中各種蛋白的表達(dá)水平:成癮相關(guān)腦區(qū)組織勻漿提取總蛋白,測定其中相關(guān)蛋白變化。肌動蛋白分為兩種形式:胞漿可溶性蛋白(G-actin)和細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白(F-actin)。采用不同緩沖液對這兩種蛋白進(jìn)行分步提取,分別觀察肌動蛋白(G-actin和F-actin)及其結(jié)合蛋白(cofilin,drebrin A/E,cortactin,WAVE-2,N-WASP,Calcinerurin A,Profilin-1,ARP2,ARP3,SSH1以及β-actin)表達(dá)變化。結(jié)果:1不同腦區(qū)在電鏡下的形態(tài)學(xué)變化:對照組海馬CA1區(qū)、前額葉皮質(zhì)和伏隔核中,突觸前可見線粒體,有大量突觸小泡,與突觸前膜相比,突觸后膜均勻增厚;啡依賴組各腦區(qū),可見突觸后膜明顯增厚;自然戒斷組,突觸后膜仍明顯增厚。2行為學(xué)癥狀評分:嗎啡戒斷14后,恢復(fù)正常;再次用嗎啡誘導(dǎo),行為學(xué)評分又顯著升高45%(P0.001)。Latrunculin A阻斷嗎啡再誘導(dǎo)后,行為學(xué)評分無顯著性變化。3 Western-blot檢測腦組織中各種蛋白的表達(dá)水平3.1 W組與NS/NS組相比:海馬中,總cortactin上調(diào)66%(P0.01);ARP2上調(diào)35%(P0.05)。前額葉皮質(zhì)中,profilin-1下調(diào)27%(P0.01)。紋狀體中,N-WASP下調(diào)20%(P0.05)。伏隔核中,P-cofilin/cofilin的比例下調(diào)20%(P0.01);WAVE-2下調(diào)45%(P0.01)。3.2 M/M組與W組相比:海馬中,F-actin/G-actin比例下調(diào)13%(P0.05);Drebrin A/E與F-actin和G-actin的結(jié)合游離比,下調(diào)12%(P0.05);cortactin與F-actin和G-actin的結(jié)合游離比,上調(diào)30%(P0.05);SSH1上調(diào)40%(P0.05);P-cofilin/cofilin比例下調(diào)36%(P0.05);N-WASP,上調(diào)42%(P0.05);calcinurin A,上調(diào)13%(P0.05)。前額葉皮質(zhì)中,總drenbrin A/E,上調(diào)58%(P0.05);P-cofilin/cofilin比例,下調(diào)13%(P0.05);calcinurin A上調(diào)50%(P0.05)。紋狀體中,總drenbrin A/E,上調(diào)45%(P0.05)。伏隔核中,calcinurin A,上調(diào)13%(P0.05)。3.3 M/Lat-A/M與M/M組相比:海馬中,Drebrin與F-actin和G-actin的結(jié)合游離比,下調(diào)20%(P0.05);SSH1,下調(diào)64%(P0.01);ARP2,下調(diào)45%(P0.05);P-cofilin/cofilin比例,上調(diào)60%(P0.05);WAVE-2,下調(diào)21%(P0.01)。前額葉皮質(zhì)中,總drenbrin A/E,下調(diào)89%(P0.01);N-WASP,上調(diào)45%(P0.05);WAVE-2,下調(diào)21%(P0.01)。紋狀體中,總drenbrin A/E,下調(diào)56%(P0.01);總cortactin,上調(diào)28%(P0.05);N-WASP,上調(diào)39%(P0.05)。伏隔核中,總cortactin,上調(diào)84%(P0.05);N-WASP,上調(diào)38%(P0.001);WAVE-2,上調(diào)29%(P0.01);calcinurin A,上調(diào)20%(P0.05)。結(jié)論:長期嗎啡處理可導(dǎo)致成癮相關(guān)腦區(qū)突觸發(fā)生可塑性變化,表現(xiàn)為突觸后膜明顯增厚,并且在戒斷癥狀消失后仍然存在。戒斷完成后再給嗎啡誘導(dǎo),可以使行為學(xué)發(fā)生變化,伴隨肌動蛋白重構(gòu),并呈現(xiàn)腦區(qū)特異性。海馬中,肌動蛋白的重構(gòu)可能與促進(jìn)蛋白核化和解聚過程有關(guān)。第二部分嗎啡誘導(dǎo)條件位置偏愛復(fù)燃大鼠海馬肌動蛋白重構(gòu)及其機制研究目的:研究嗎啡誘導(dǎo)條件位置偏愛復(fù)燃大鼠海馬肌動蛋白的變化方法:1嗎啡誘導(dǎo)CPP復(fù)燃模型制備:清潔級雄性SD大鼠32只,按隨機分組原則分組,分為N1:NS/NS組,N2:M/NS/M組,N3:M/Lat-A/M組,N4:M/FK-506/M組,每組8只。適應(yīng)期:1-3天,每天對所有組動物進(jìn)行CPP監(jiān)測,每次15min,確定動物的偏愛環(huán)境。訓(xùn)練期:4-11天,N2、N3及N4組動物,每天上午腹腔注射嗎啡10mg/kg,放入伴藥箱中,訓(xùn)練40 min;下午注射等體積生理鹽水,放入非伴藥箱中,訓(xùn)練40min。N1組,注射等體積生理鹽水,進(jìn)行相同訓(xùn)練。測試期:第12天,所有組動物均進(jìn)行CPP監(jiān)測。戒斷期:每5天測試一次,約需15天戒斷完成。再誘導(dǎo)期:N1組動物,腹腔注射等體積生理鹽水;N2、N3及N4組動物,雙側(cè)海馬各給以1μL溶劑、0.5μg/μL Latrunculin A及5.0μg/μL FK-506,30min后,腹腔注射10mg/kg嗎啡。所有組動物腹腔注射藥物15min后,進(jìn)行CPP測試。所有組動物,在所有測試完成后,立馬戊巴比妥鈉麻醉,斷頭取腦,分離相關(guān)腦區(qū):海馬(Hip)和伏隔核(NAc)。2 Western-blot檢測腦組織中各種蛋白的表達(dá)水平成癮相關(guān)腦區(qū)組織勻漿提取總蛋白,測定其中相關(guān)蛋白變化。采用不同緩沖液對這兩種蛋白進(jìn)行分步提取,分別觀察海馬中肌動蛋白(G-actin和F-actin)及其結(jié)合蛋白(cofilin,P-cofilin,drebrin A/E,cortactin,N-WASP,Calcinerurin A,Glutamate Receptor 1,P-Glutamate Receptor 1以及β-actin)表達(dá)變化。結(jié)果:1嗎啡誘導(dǎo)CPP行為評分:在CPP實驗訓(xùn)練完成24h后,嗎啡組CPP評分與對照組相比,上升400%(p0.05);待大鼠CPP行為完全消退后,再次嗎啡誘導(dǎo),CPP評分上升1200%(P0.01);與嗎啡誘導(dǎo)組相比,腦室給Latrunculin A和FK-506組CPP評分分別下調(diào)1204%(P0.001)、1260%(P0.001)。2嗎啡誘導(dǎo)CPP復(fù)燃大鼠海馬和伏隔核蛋白表達(dá)變化2.1 M/NS/M組與NS/NS組相比:海馬中,F-actin/G-actin比例,下調(diào)50%(P0.05);Drebrin A/E與F-actin和G-actin的結(jié)合游離比,下調(diào)10%(P0.05);cortactin與F-actin和G-actin的結(jié)合游離比,下調(diào)35%(P0.05);P-Glu R1/Glu R1比例,上調(diào)45%(P0.05);Calcineurin A,上調(diào)15%(P0.05)。伏隔核中,P-Glu R1/Glu R1比例,上調(diào)20%(P0.05)。2.2 M/Lat-A/M組與M/NS/M組相比:海馬中,F-actin/G-actin比例,上調(diào)47%(P0.01);cortactin與F-actin和G-actin的結(jié)合游離比,上調(diào)35%(P0.05);P-Glu R1/Glu R1比例,下調(diào)65%(P0.01)。伏隔核中,P-Glu R1/Glu R1比例,下調(diào)70%(P0.01)。2.3 M/FK-506/M組與M/NS/M組相比:海馬中,F-actin/G-actin比例,上調(diào)50%(P0.05);Drebrin A/E與F-actin和G-actin的結(jié)合游離比,上調(diào)60%(P0.05);cortactin與F-actin和G-actin的結(jié)合游離比,上調(diào)50%(P0.05);P-Glu R1/Glu R1比例,下調(diào)60%(P0.05);Calcineurin A,下調(diào)15%(P0.05)。伏隔核中,P-Glu R1/Glu R1比例,下調(diào)50%(P0.01)。結(jié)論:嗎啡可誘導(dǎo)大鼠CPP行為消退后復(fù)燃,并伴隨海馬肌動蛋白重構(gòu);背側(cè)海馬給入Lantruculin A和FK506可抑制嗎啡誘導(dǎo)的大鼠CPP行為復(fù)燃,其作用機制可能與抑制海馬肌動蛋白重構(gòu),改變海馬投射到伏隔核的谷氨酸能神經(jīng)活性有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R749.6

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 虞冉;葉政;李晶;李敏;白羽;潘群皖;;嗎啡誘導(dǎo)條件性位置偏愛大鼠伏隔核殼區(qū)遙測電活動分析[J];中國應(yīng)用生理學(xué)雜志;2015年01期

2 朱再滿;華田苗;周鴻銘;潘群皖;李晶;李敏;;海洛因誘導(dǎo)CPP大鼠伏隔核腦電活動的無線遙測研究[J];中國應(yīng)用生理學(xué)雜志;2014年04期

3 閆彩珍;于亮;劉川;郝曉玲;王天魁;;嗎啡依賴大鼠不同腦區(qū)肌動蛋白及其結(jié)合蛋白的表達(dá)變化[J];中國藥理學(xué)通報;2011年08期

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本文編號：1249304