本文關鍵詞：吉林省扶余市華支睪吸蟲感染的分子流行病學研究

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【摘要】：華支睪吸蟲病(Clonorchiasis)又稱為肝吸蟲病,是由華支睪吸蟲(Clonorchis sinensis)寄生于人和哺乳動物肝膽管內引起的一種嚴重的食源性人獸共患寄生蟲病。當人們因生食或半生食含有活的華支睪吸蟲囊蚴的魚蝦后,即可感染,并在人體內發(fā)育為成蟲并排卵。華支睪吸蟲主要分布于東亞及東南亞地區(qū),全球大概有三千多萬人感染,其中僅中國感染人數就占了一半左右,是深受華支睪吸蟲危害的國家之一。吉林省是我國華支睪吸蟲感染的高發(fā)區(qū)域,其中扶余市是沿松花江流域的重災區(qū)之一,對該地區(qū)進行華支睪吸蟲病的流行病學調查勢在必行。同時為明確物種基因型,對該地區(qū)的華支睪吸蟲種株進行分子生物學分析,這對于了解物種的特異性有重大意義,同時建立分子生物學診斷方法,為臨床診斷及防治提供了重要的分子生物學信息和方法。因此我們展開了對扶余市華支睪吸蟲感染的分子流行病學研究。(1)扶余市沿江流域的流行病學調查我們對當地的三個鎮(zhèn)子的14個村子,2142名村民進行了問卷調查,共收集到糞便樣本1745份。利用改良加藤厚涂片對糞便樣本進行初步篩查,共得到含有蟲卵的陽性糞便樣本513份。同時獲得513份血清,最后通過實驗室篩選后為實驗室診斷試劑盒的研制提供陽性血清標本。對調查問卷中的相關數據(性別、年齡、生食魚蝦習慣、飲酒)進行了統(tǒng)計學分析,結果顯示,男女感染比例分別是36.2%和21.3%,差異顯著(P0.01);患病率較高的年齡段集中在40-59歲;生食魚蝦習慣和飲酒習慣對于感染比率也存在顯著差異(P0.01,OR分別是3.211,1.97)。為進一步了解華支睪吸蟲感染后可造成肝膽管的增粗、管壁增厚等影像學變化,我們對之前的513個陽性人群進行了肝膽胰脾的超聲檢查,結果顯示其中18%的人的超聲檢查表現為肝內小膽管彌漫性的擴張和肝內膽管壁的增厚,2.5%表現為膽囊內不連續(xù)的梭形浮動的回聲或膽囊結石表現。同時,我們對當地環(huán)境及三個鎮(zhèn)子市售的10種淡水魚和蝦進行了囊蚴檢測,發(fā)現其中麥穗魚、白魚、船丁魚的囊蚴感染率較高。通過流行病學的調查得到的結論是:1)改良加藤厚涂片法仍是規(guī)模性華支睪吸蟲病現場檢測的快速手段;2)生食魚蝦的習慣是感染華支睪吸蟲的重要途徑,同時男性、高年齡及飲酒習慣都影響感染率的危險因素;3)超聲檢查可作為華支睪吸蟲病診斷的便捷的輔助檢查方法;4)改善衛(wèi)生環(huán)境及不良的飲食習慣是控制該病的根本措施。(2)華支睪吸蟲的特異性引物設計及篩選在對當地的市售魚進行囊蚴檢測的過程中,我們在魚體內發(fā)現了形態(tài)似華支睪吸蟲囊蚴和東方次睪吸蟲的囊蚴。為從分子水平明確物種,也為后續(xù)的蟲卵物種鑒定奠定基礎,我們利用Gen Bank中的序列,通過對比,尋找特異性的保守區(qū),從而設計出幾對引物并進行篩選。利用普通PCR和多重PCR對引物進行篩選。結果尋找到Cs F2R3作為華支睪吸蟲的特異性引物和Mo F2R2作為東方次睪吸蟲特異性引物,測序結果顯示兩對引物擴增的序列分別與所鑒定物種具有高度同源性。(3)華支睪吸蟲病的分子生物學診斷方法的建立和優(yōu)化利用已經篩選出來的華支睪吸蟲的特異性引物,建立PCR反應體系,并對反應條件進行優(yōu)化,包括引物、模板濃度及反應時間等,從而獲得最佳反應體系及反應條件,目的是為增加診斷的靈敏度,從而為后續(xù)的糞便蟲卵DNA的基因擴增提供技術支持。通過反復的探索,最終我們成功建立了以華支睪吸蟲DNA為模板的基因診斷方法。(4)扶余市松花江流域華支睪吸蟲的蟲種鑒定及核酸序列分析為了解扶余市松花江流域華支睪吸蟲的基因型,利用已經篩選到的華支睪吸蟲和東方次睪吸蟲特異性引物對糞便中的蟲卵DNA進行多重PCR,從而鑒定蟲種及獲得基因序列。結果顯示513個蟲卵陽性的糞便樣本中均未發(fā)現東方次睪吸蟲的感染,其中的265(51.7%)個樣本顯示為華支睪吸蟲蟲卵。通過BLAST對所獲得的序列進行比對,結果顯示與華支睪吸蟲ITS2注冊序列中的AF217099和AF217094同源性可達到99-100%。結論:PCR的方法是診斷華支睪吸蟲病非常有效的確診手段,雖操作相對繁瑣,卻增加了華支睪吸蟲病診斷的精確性,減少了誤診率,可作為確診手段;通過PCR的方法我們篩選出了標準的華支睪吸蟲病患者的陽性血清,為診斷性試劑盒的研制提供了重要的標本支持。
【關鍵詞】：華支睪吸蟲 分子流行病學 囊蚴 診斷
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R532.23;R181.3
【目錄】：

• 前言4-5
• 中文摘要5-7
• Abstract7-13
• 中英文縮略詞對照表13-14
• 第1章 緒論14-28
• 1.1 引言14
• 1.2 文獻綜述14-26
• 1.2.1 華支睪吸蟲及華支睪吸蟲病14-16
• 1.2.2 華支睪吸蟲病的病理生理及臨床表現16-18
• 1.2.3 華支睪吸蟲病的流行病學概況18-19
• 1.2.4 華支睪吸蟲病的診斷方法的研究進展19-22
• 1.2.5 華支睪吸蟲病的防治22-24
• 1.2.6 華支睪吸蟲感染與CCA關系24-25
• 1.2.7 研究熱點25-26
• 1.3 研究思路26-28
• 第2章 扶余市人群華支睪吸蟲感染的流行病學調查28-40
• 2.1 研究對象及樣本采集28
• 2.2 實驗材料28-29
• 2.3 實驗方法29
• 2.3.1 問卷調查29
• 2.3.2 制作鏡檢加藤片29
• 2.3.3 顯微鏡下查找蟲卵及蟲卵計數29
• 2.3.4 腹部超聲檢查29
• 2.4 實驗結果29-36
• 2.4.1 統(tǒng)計分析結果29-32
• 2.4.2 糞樣中蟲卵及蟲卵計數32-33
• 2.4.3 超聲影像33-36
• 2.5 討論36-40
• 第3章 扶余市淡水魚的華支睪吸蟲感染情況調查40-52
• 3.1 扶余市淡水魚養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境調查40-42
• 3.1.1 扶余市地理位置40-41
• 3.1.2 淡水魚養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境調查41-42
• 3.2 市售淡水魚的感染情況調查42-49
• 3.2.1 研究對象和樣本收集42
• 3.2.2 實驗材料42-43
• 3.2.3 實驗方法43-46
• 3.2.4 實驗結果46-49
• 3.3 討論49-52
• 第4章 華支睪吸蟲特異性引物的設計及篩選52-62
• 4.1 實驗材料52
• 4.1.1 儀器52
• 4.1.2 試劑52
• 4.1.3 試劑配制52
• 4.2 實驗方法52-55
• 4.2.1 引物設計52-54
• 4.2.2 引物篩選54-55
• 4.3 實驗結果55-60
• 4.3.1 Cs DNA標準品的鑒定結果55-56
• 4.3.2 Mo DNA標準品的鑒定結果56
• 4.3.3 梯度PCR篩選結果56-60
• 4.4 討論60-62
• 第5章 華支睪吸蟲病的分子生物學診斷62-70
• 5.1 實驗材料62-63
• 5.1.1 儀器62
• 5.1.2 試劑62-63
• 5.2 實驗方法63-66
• 5.2.1 收集蟲卵63
• 5.2.2 提取蟲卵DNA63-64
• 5.2.3 多重PCR擴增及測序64-66
• 5.2.4 重復PCR66
• 5.3 實驗結果66-67
• 5.3.1 糞便蟲卵多重PCR鑒定結果66-67
• 5.3.2 重復PCR鑒定67
• 5.3.3 基因序列比對結果67
• 5.4 討論67-70
• 第6章 結論70-72
• 參考文獻72-88
• 作者簡介及在學期間所取得的科研成果88-90
• 致謝90

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8 鐘睿，

本文編號：827559