【摘要】： 背景 博爾納病病毒(Borna disease virus,BDV)是新發(fā)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性病毒,它是一種未分段的有包膜的單股負(fù)鏈RNA病毒,與纖絲病毒科、副粘病毒科和彈狀病毒科共同歸屬于單股負(fù)鏈RNA病毒目(Monnegaviradae),并針對本病毒特設(shè)Borna病毒科Borna病毒屬。1895年BDV在德國博爾納(Borna)小鎮(zhèn)的馬群中引起爆發(fā)流行,因此得名。 迄今,關(guān)于BDV在自然界中的宿主、全球范圍分布及傳播途徑等不斷有了新的發(fā)現(xiàn)。最初認(rèn)為BDV感染僅限于德國和瑞士的馬群和羊群,偶見散發(fā)病例。近年來,隨著更多BDV診斷技術(shù)的出現(xiàn)和世界各國對BDV研究的深入,已知的感染動(dòng)物種類逐年增加。在自然條件下,包括雞、山羊、兔、驢、美洲駝、羊駝、牛、狗、貓以及鴕鳥等在內(nèi)的多種溫血?jiǎng)游锞赡鼙籅DV感染。已有的研究表明人群與動(dòng)物的BDV感染遍布?xì)W洲、亞洲和美洲等多個(gè)地區(qū),估計(jì)其實(shí)際地理分布可能更廣泛。該病毒的傳播途徑目前仍不清楚,已知的研究發(fā)現(xiàn)該病毒可能隨感染動(dòng)物的呼吸道、結(jié)膜和糞便分泌物排出,通過鼻腔傳播感染其他動(dòng)物和人類。 在我國,Hagiwara K、朱丹、楊愛英、徐平、趙立波、劉慶軍、王振海和Chen CH等相繼報(bào)道在新疆、黑龍江、重慶、寧夏、貴州及臺(tái)灣的人、馬和綿羊等出現(xiàn)BDV的自然感染,說明中國地區(qū)動(dòng)物和人也存在BDV的自然感染,但在不同時(shí)間階段動(dòng)物和人的BDV自然感染情況及傳播來源、傳播途徑等尚不清楚。 目的 本研究旨在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,在國家高技術(shù)發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃,2006AA02Z196)的支持下,研究中國新疆和重慶地區(qū)多物種BDV的自然感染,并分析其種系發(fā)生來源,為追查感染源、分析BDV的地理分布和闡明種內(nèi)和種間傳播,為部分神經(jīng)精神疾病的病因?qū)W診斷及其防治提供新的思路和依據(jù)。 方法 1.采用前期開發(fā)的Borna病病毒熒光定量PCR診斷試劑盒,采用熒光定量套式逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Fluorescence quantitative nested transcription polymerase chain reaction,FQ-nRT-PCR)檢測新疆伊犁地區(qū)放養(yǎng)的518匹健康伊犁馬和200頭健康新疆驢外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中的BDV p24片段,采用普通逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)來檢測同樣樣本的BDV p40基因片段進(jìn)行更深層次的驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)所用BDV p24熒光定量PCR診斷試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品為PMD19質(zhì)粒,為了排除質(zhì)粒污染的可能性,同時(shí)對所有樣本進(jìn)行了PMD19質(zhì)粒的檢測。檢出陽性樣本的BDV p24片段序列進(jìn)入NCBI進(jìn)行Blast后與GenBank中5個(gè)國家7個(gè)動(dòng)物種屬33例BDV p24基因序列和前期新疆地區(qū)BDV p24片段陽性的伊犁馬3例BDV p24基因序列進(jìn)行比對,分析其核苷酸和氨基酸序列同源性,重建基因系統(tǒng)發(fā)生樹,分析伊犁馬和新疆驢中BDV可能的來源和傳播途徑。 2.采用FQ-nRT-PCR檢測重慶地區(qū)健康牛、山羊和豬各50例PBMCs中BDV p24片段,采用普通RT-PCR來檢測同樣樣本的BDV p40基因片段進(jìn)行更深層次的驗(yàn)證。此外為了排除質(zhì)粒污染的可能性,我們對所有樣本進(jìn)行了PMD19質(zhì)粒的檢測。檢出陽性樣本的BDV p24片段序列進(jìn)入NCBI進(jìn)行Blast后與GenBank中5個(gè)國家7個(gè)動(dòng)物種屬33例BDV p24基因序列和前期重慶地區(qū)BDV p24片段陽性的家雞、山羊、狗、鴿子、家兔和豬6例BDV p24基因序列進(jìn)行比對,分析其核苷酸和氨基酸序列同源性,重建基因系統(tǒng)發(fā)生樹,比較在不同時(shí)間階段BDV自然感染率有無變化;比較在不同物種不同時(shí)間階段種系來源有無不同,從而為進(jìn)一步探討B(tài)DV的自然感染來源和傳播途徑打下基礎(chǔ)。 3.采用FQ-nRT-PCR檢測病毒性腦炎(Viral encephalitis,VE)患者20例、非中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者52例和健康獻(xiàn)血者18例PBMCs中BDV p24片段,采用普通RT-PCR來檢測同樣樣本的BDV p40基因片段進(jìn)行更深層次的驗(yàn)證。此外為了排除質(zhì)粒污染的可能性,我們對所有樣本進(jìn)行了PMD19質(zhì)粒的檢測。檢出陽性樣本BDV p24片段序列進(jìn)入NCBI進(jìn)行Blast后與GenBank中5個(gè)國家7個(gè)動(dòng)物種屬33例BDV p24基因序列和前期重慶地區(qū)BDV p24片段陽性的精神分裂癥、帕金森病(Parkinson's disease,PD)、吉蘭巴雷綜合征(Guillain-Barrésyndrome,GBS)和VE患者4例BDV p24基因序列進(jìn)行序列和進(jìn)化分析,分析其核苷酸和氨基酸序列同源性,重建基因系統(tǒng)發(fā)生樹,比較在不同時(shí)間階段自然感染率有無變化;比較在不同病種不同時(shí)間階段種系來源有無不同,從而為進(jìn)一步探討B(tài)DV的自然感染來源和傳播途徑打下基礎(chǔ)。 結(jié)果 1.使用FQ-nRT-PCR對新疆伊犁地區(qū)動(dòng)物樣本RNA進(jìn)行BDV p24基因片段檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn),9例樣本BDV p24檢測陽性(伊犁馬:5/518,0.97%;新疆驢:4/200,2.00%);檢出BDV p40片段陽性9例,與BDV p24陽性結(jié)果一致,其余樣本均為陰性;在BDV p24和p40檢測結(jié)果均為陽性的樣本中未檢出質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品,顯示所有檢測樣本均未發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)品污染;9例陽性樣本BDV p24基因片段的序列完全相同,與BDV標(biāo)準(zhǔn)病毒株Strain V、H1766和He/80等比對,9例陽性樣本核苷酸和氨基酸同源相似性分別為94%～100%和82%～100%,其中與He/80株同源性最高為100%;與前期新疆地區(qū)伊犁馬3例BDV p24基因序列比對,9例陽性樣本核苷酸和氨基酸同源相似性分別為99%～100%和96%～100%;本次檢測9例陽性樣本和前期伊犁馬3例陽性樣本BDV p24片段序列匯聚德國-瑞士-奧地利-日本-中國新疆混合支系。 2.使用FQ-nRT-PCR對重慶地區(qū)動(dòng)物樣本RNA進(jìn)行BDV p24基因片段檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn),7例樣本BDV p24檢測陽性(牛:3/50,6.00%;羊:2/50,4.00%;豬:2/50,4.00%);檢出BDV p40片段陽性7例,與BDV p24陽性結(jié)果一致,其余樣本均為陰性;在BDV p24和p40檢測結(jié)果均為陽性的樣本中未檢出質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品,顯示所有檢測樣本均未發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)品污染;本次實(shí)驗(yàn)檢測7例牛、山羊和豬陽性樣本核苷酸序列和氨基酸序列完全相同,與BDV標(biāo)準(zhǔn)病毒株Strain V、H1766和He/80等比對,7例陽性樣本核苷酸和氨基酸同源相似性分別為94%～100%和82%～100%;與前期重慶地區(qū)家雞、山羊、狗、鴿子、家兔和豬6例BDV p24基因序列比對,同源相似性分別為94%～100%和82%～100%;本次檢測7例陽性樣本BDV p24片段序列和前期檢測重慶地區(qū)豬的BDV p24片段序列匯聚德國-瑞士-奧地利-日本-中國重慶混合支系,前期檢測的家雞、山羊、狗、鴿子、家兔陽性樣本BDV p24基因片段序列形成中國重慶獨(dú)立支系。 3.使用FQ-nRT-PCR對重慶地區(qū)人樣本RNA進(jìn)行BDV p24基因片段檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn),5例樣本BDV p24檢測陽性(VE患者:3/20,15.00%;腦血管病(Cerebrovascular disease,CVD)患者:2/32,6.25%;GBS患者、癲癇患者、多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis,MS)患者、PD患者、酒精中毒性腦病和健康獻(xiàn)血者均為陰性);檢出BDV p40片段陽性5例,與BDV p24陽性結(jié)果一致,其余樣本均為陰性;在BDV p24和p40檢測結(jié)果均為陽性的樣本中未檢出質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品,顯示所有檢測樣本均未發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)品污染;與BDV標(biāo)準(zhǔn)病毒株Strain V、H1766和He/80等比對,本次實(shí)驗(yàn)檢測2例VE患者和2例CVD患者樣本核苷酸和氨基酸同源相似性分別為94%～100%和82%～100%;1例VE患者為95%～98%和89%～93%;與前期重慶地區(qū)精神分裂癥、PD、GBS和VE患者4例BDV p24基因序列比對,2例VE患者和2例CVD患者樣本核苷酸和氨基酸同源相似性分別為94%～97%和82%～89%,1例VE患者為95%～100%和93%～100%;本次檢測4例陽性樣本(2例CVD患者和2例VE患者)BDV p24片段序列匯聚德國-瑞士-奧地利-日本-中國重慶混合支系,另外1例VE患者陽性樣本和前期檢測的精神分裂癥、PD、GBS和VE患者樣本BDV p24基因片段序列形成中國重慶獨(dú)立支系。 結(jié)論 1.中國新疆地區(qū)健康伊犁馬和新疆驢存在BDV的自然感染。根據(jù)種系發(fā)生學(xué)分析其感染的BDV可能是由于該病毒在德國、瑞士、奧地利、日本和中國各國的相互傳播引起。在重新構(gòu)建的種系發(fā)生樹分支內(nèi)部,BDV在伊犁馬和新疆驢存在高度的同源性,說明不同宿主之間可能存在動(dòng)物和動(dòng)物之間的循環(huán)傳播。 2.中國重慶地區(qū)健康牛、山羊和豬中存在BDV的自然感染。根據(jù)種系發(fā)生學(xué)分析,重慶地區(qū)動(dòng)物宿主可能存在地源性BDV獨(dú)立株和源于外來疫病病原傳入的流行株。在不同物種和時(shí)期,BDV種系可能不同,可表現(xiàn)為某一種系為主,說明BDV及其宿主可能存在進(jìn)化和變異的穩(wěn)定平衡。 3.中國重慶地區(qū)VE患者和CVD患者中存在BDV的自然感染。根據(jù)種系發(fā)生學(xué)分析,重慶地區(qū)人宿主可能存在地源性BDV獨(dú)立株和源于外來疫病病原傳入的流行株,該結(jié)論與重慶地區(qū)動(dòng)物一致,不同宿主之間可能存在動(dòng)物和動(dòng)物、動(dòng)物和人類、人類和人類之間的循環(huán)傳播。
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【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R181.3

【參考文獻(xiàn)】

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2 趙立波;謝鵬;牟君;李亞軍;張小東;鄒德智;劉慶軍;;重慶市山羊博爾納病病毒P24基因的檢測[J];中國獸醫(yī)科學(xué);2006年06期

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本文編號：2383672