【摘要】： 目的： 為MS2噬菌體替代脊髓灰質(zhì)炎病毒Ⅰ型(PV-Ⅰ)疫苗株作為指示病毒用于消毒劑效果評價提供進一步的理論和實驗依據(jù)，試驗觀察MS2噬菌體的部分生物學(xué)特性以及對二氯異氰尿酸鈉消毒劑(NaDDC)的抵抗力，并在此基礎(chǔ)上進一步研究二氯異氰尿酸鈉作用MS2噬菌體的滅活機理。 方法： 本研究分為兩部分： 1．MS2噬菌體的部分生物學(xué)特性研究： 1．1 MS2噬菌體增殖特性的研究：方法參照文獻作適當(dāng)改動進行研究。按照感染復(fù)數(shù)(MOI)分別為0.0001、0.001、0.01、0.1、1和10加入噬菌體純培養(yǎng)液和宿主菌，37℃160r／min培養(yǎng)4h后，測定噬菌體滴度；加入噬菌體及宿主菌，使MOI=10，37℃溫育15 min后，進行一步生長實驗，于各時間取樣300μl測定上清中噬菌體滴度； 1．2 MS2噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)的研究：參照Lu等的方法，略有改動。 1．3 MS2噬菌體的宿主菌范圍研究：主要采用雙層瓊脂法測定MS2噬菌體對各試驗菌株的感染裂解情況，觀察MS2噬菌體的噬菌斑生長情況并計數(shù)，并初步比較MS2噬菌體在相關(guān)宿主菌內(nèi)的易感性。 1．4 MS2噬菌體對消毒劑抵抗力的研究：采用懸液定量滅活試驗、中和劑鑒定試驗、噬菌體的檢測采用雙層瓊脂法，實驗參照消毒技術(shù)規(guī)范(2002版)規(guī)定，并作適當(dāng)修改；選擇二氯異氰尿酸鈉消毒劑，觀察其滅活MS2、噬菌體的效果。 2．二氯異氰尿酸鈉消毒劑滅活MS2噬菌體機理的研究： 2．1 NaDDC消毒劑對MS2噬菌體核酸影響的研究：采用RT-PCR技術(shù)，使用prime premier軟件設(shè)計引物，并通過blastn比對以及預(yù)試驗檢驗引物特異性，觀察消毒劑滅活MS2噬菌體后，其四個基因是否發(fā)生改變； 2．2 NaDDC消毒劑對MS2噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白影響的研究：使用透射電鏡觀察消毒劑滅活MS2噬菌體后，病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)是否發(fā)生改變，病毒對性菌毛的吸附性是否仍然存在；采用血清中和試驗觀察MS2噬菌體經(jīng)二氯異氰尿酸鈉作用后，是否喪失抗原性。方法分別參考相關(guān)文獻，并做改進。 結(jié)果： 1 MS2噬菌體的部分生物學(xué)特性研究： 1．1 MS2噬菌體的增殖特性：一步生長曲線結(jié)果表明MS2噬菌體感染宿主菌大腸桿菌ATCC15779的潛伏時間約為20min，爆發(fā)時間約為90min，裂解量為77； 1．2 MS2噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)：MS2噬菌體感染其宿主菌的最佳感染復(fù)數(shù)在0.001～0.01之間； 1．3 MS2噬菌體的宿主菌范圍：宿主菌范圍研究中選擇的八種細菌中，大腸桿菌ATCC 15597、大腸桿菌285和大腸桿菌B這三種菌為MS2噬菌體的宿主菌，MS2噬菌體對這三種宿主菌易感性由高到低順序為：大腸桿菌ATCC 15597＞大腸桿菌285＞大腸桿菌B。 1．4 MS2噬菌體對消毒劑的抵抗力：消毒劑滅活MS2噬菌體結(jié)果如下，300mg／L的二氯異氰尿酸鈉與MS2噬菌體作用40min，MS2的LIV為2.14Log10；400mg／L的二氯異氰尿酸鈉與MS2噬菌體作用40min LIV為2.60Log10；500mg／L的二氯異氰尿酸鈉與MS2噬菌體作用20min LIV可達到4.39Log10；600mg／L的二氯異氰尿酸鈉與MS2噬菌體作用5min LIV分別可達到5.33 Loa10；700mg／L的二氯異氰尿酸鈉與MS2噬菌體作用5min的LIV為＞5.80Log10。 2二氯異氰尿酸鈉消毒劑滅活MS2噬菌體機理的研究： 2．1 NaDDC消毒劑對MS2噬菌體核酸影響的研究：RT-PCR試驗結(jié)果表明，，完全滅活的600mg／L 10min和800mg／L5min兩個消毒劑濃度滅活MS2噬菌體后，其四個基因均被破壞； 2．2 NaDDC消毒劑對MS2噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白影響的研究：MS2噬菌體被完全滅活后，在電鏡下觀察到，MS2斷裂成直徑約10nm大小的不規(guī)則的圓形碎片，喪失吸附能力，無法吸附在宿主菌性菌毛上。對MS2噬菌體抗原性影響的血清學(xué)實驗：MS2噬菌體被完全滅活后，喪失其抗原性。 結(jié)論： 1 MS2噬菌體的部分生物學(xué)特性研究： 1．1 MS2噬菌體感染宿主菌大腸桿菌ATCC15779的潛伏時間短； 1．2最佳感染復(fù)數(shù)在0.001～0.01之間； 1．3對宿主菌大腸桿菌ATCC15779的易感性最高； 1．4二氯異氰尿酸鈉對MS2噬菌體可起到良好的滅活作用。 2二氯異氰尿酸鈉消毒劑滅活MS2噬菌體機理的研究； 2．1二氯異氰尿酸鈉滅活MS2噬菌體后，其四個基因均被破壞； 2．2蛋白質(zhì)外殼的形態(tài)發(fā)生了改變，斷裂成圓形碎片，并喪失了吸附宿主菌性菌毛的能力，抗原性也喪失了。
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【學(xué)位授予單位】：四川大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R187

【參考文獻】

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本文編號：2362354