【目的】本研究通過(guò)對(duì)臨床上牙周炎患者與健康患者牙齦組織中炎癥細(xì)胞和自噬相關(guān)基因的表達(dá)的檢測(cè),初步分析自噬與炎癥的相關(guān)性。然后構(gòu)建大鼠牙周炎模型,通過(guò)藥物抑制自噬,檢測(cè)是否可以通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥激活的自噬來(lái)抑制炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)以及牙槽骨的吸收,并在體外驗(yàn)證自噬調(diào)節(jié)對(duì)于破骨細(xì)胞的影響,以期能進(jìn)一步揭示自噬在牙周炎炎癥性骨吸收中的作用,為通過(guò)調(diào)控細(xì)胞自噬進(jìn)行預(yù)防和治療牙周炎提供新的思路�！痉椒ā勘狙芯堪伺R床研究、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)。在臨床研究中,收集牙冠延長(zhǎng)術(shù)中或開(kāi)窗助萌術(shù)中切取的牙齦組織,作為健康牙齦組織;收集拔除無(wú)法保留重度牙周炎患牙時(shí)的牙齦組織,作為慢性牙周炎患者牙齦組織。再通過(guò)蘇木精伊紅染色、免疫組織化學(xué)染色等方法觀察牙齦組織中炎癥因子細(xì)胞以及自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,我們通過(guò)建立大鼠牙周炎模型,同時(shí)進(jìn)行牙齦局部注射自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）或氯喹（CQ）來(lái)進(jìn)一步探究自噬在牙周炎炎癥發(fā)生發(fā)展和骨代謝環(huán)節(jié)中的作用。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為以下6組:1)正常組;2)牙周炎組;3)牙周炎+低濃度3-甲基腺嘌呤組;4)牙周炎+高濃度3-甲基腺嘌呤組;5)牙周炎+低濃度氯喹組;6)牙... 

【文章來(lái)源】：南京大學(xué)江蘇省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：67 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

自噬形成過(guò)程的分子機(jī)制在起始誘導(dǎo)階段，哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetofrapamycin,mTOR）作為重要的細(xì)胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)和能量狀態(tài)感受體，參與調(diào)控自噬的發(fā)生[6]；在成

南京大學(xué)碩士學(xué)位論文182.3.2HE染色觀察牙齦組織形態(tài)組織病理學(xué)檢查（HE染色）結(jié)果顯示：正常（PH）組牙齦上皮釘突較短、結(jié)締組織內(nèi)可見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)或無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)；慢性牙周炎（CP）組上皮釘突明顯伸長(zhǎng)、可呈網(wǎng)狀，且結(jié)締組織內(nèi)可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2-1）。圖2-1健康（PH）組牙齦和慢性牙周炎組(CP)牙齦的組織病理學(xué)特點(diǎn)。（A）正常牙齦（100×）；（B）炎癥牙齦（100×）；（C）正常牙齦（400×）；（D）炎癥牙齦（400×）。2.3.3牙齦組織中巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞表達(dá)情況通過(guò)免疫組化染色的方法觀察了正常組和慢性牙周炎組牙齦組織中巨噬細(xì)胞和漿細(xì)胞的表達(dá)情況。CD68、CD19、CD138染色結(jié)果顯示，CP組CD68+細(xì)胞數(shù)明顯高于PH組，此外CP組CD19+細(xì)胞和CD138+細(xì)胞也明顯多于PH組，其差異具有統(tǒng)計(jì)意義（p<0.0001）（圖2-2）。

南京大學(xué)碩士學(xué)位論文29同上），同時(shí)使用探針將109CFU/mL的新鮮P.gingivalis菌液接種于絲線結(jié)扎的牙位處，并檢查絲線結(jié)扎情況以及大鼠牙周狀況，若有松脫則及時(shí)重新結(jié)扎；（4）取材：給藥21天后，全部組的大鼠給予過(guò)量麻藥進(jìn)行安樂(lè)死。收集大鼠上頜雙側(cè)頜骨標(biāo)本：右側(cè)上頜骨標(biāo)本置于4%多聚甲醛中固定，用于后續(xù)的Micro-CT以及組織病理學(xué)檢測(cè)，左側(cè)的上頜骨標(biāo)本用于收集實(shí)驗(yàn)牙腭側(cè)牙齦組織。圖3-2大鼠牙周炎模型建立。3.2.6大鼠頜骨Micro-CT檢測(cè)與牙槽骨吸收情況測(cè)量將大鼠右側(cè)上頜骨浸泡在4%多聚甲醛中固定48小時(shí)后，用QuantumGXMicro-CT進(jìn)行掃描，掃描參數(shù)為：掃描分辨率36μm，管電壓90Kv，管電流80μA，掃描方式360°旋轉(zhuǎn)，掃描時(shí)間14分鐘。使用Analyzed12.0軟件對(duì)掃描獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行三維重建，獲得上頜第二磨牙腭側(cè)的三維數(shù)字化圖像。測(cè)量上頜第二磨牙釉牙骨質(zhì)界（cemento-enameljunction,CEJ）至牙槽嵴頂（alveolarbonecrest,ABC）間的線性距離作為評(píng)價(jià)牙槽骨吸收情況的方法[28]。根據(jù)斷層測(cè)量法[29,30]，分析之前在軟件中將獲得的每個(gè)樣本所有斷層圖像重新定向，以使掃描軸和解剖位置一致[31]。然后將上頜第二磨牙咬合面近遠(yuǎn)中向長(zhǎng)軸、咬合面、牙體長(zhǎng)軸分別于軟件中的X、Y、Z軸相平行。測(cè)點(diǎn)某位點(diǎn)的CEJ-ABC時(shí)，使Z軸通過(guò)該位點(diǎn)，然后測(cè)量此處的距離。分別測(cè)量了腭側(cè)近中2個(gè)位點(diǎn)、腭側(cè)中間1個(gè)位點(diǎn)和腭側(cè)遠(yuǎn)中2個(gè)位點(diǎn)，將5個(gè)位點(diǎn)的測(cè)量值的平均值作為該實(shí)驗(yàn)牙的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。3.2.7組織病理學(xué)評(píng)估完成Micro-CT掃描后，取出已固定48小時(shí)的大鼠右側(cè)上頜骨，并對(duì)其進(jìn)行修整，去除多余的部分。然后將標(biāo)本放入10%EDTA脫鈣液中進(jìn)行脫鈣，每3天更換一次脫鈣液，直到針能輕松地刺入骨組織并且無(wú)阻力感（此為脫鈣結(jié)點(diǎn)，一般需要2-3個(gè)月）?

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]兩種利用micro-CT測(cè)量小鼠牙周炎模型牙槽骨吸收的方法比較[J]. 崔迪,張楊珩,張婷,魏挺力,閆福華.  中國(guó)介入影像與治療學(xué). 2017(03)



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