目的:探討X射線對MC3T3-E1小鼠成骨細胞增殖、凋亡和礦化能力的影響,并從自噬角度初步闡述其可能的分子機制。方法:體外培養(yǎng)MC3T3-E1細胞,以6MV/min劑量脈沖速率的醫(yī)用直線加速器照射,分組如下:空白對照組、0.25 Gy組、0.5 Gy組、1 Gy組、2 Gy組和4 Gy組。采用MTT法篩選多西環(huán)素(doxycycline,DOX)作用濃度,通過單丹磺酰尸胺(monodansylcadaverine,MDC)染色法確定DOX抑制自噬現象的作用時間,篩選多西環(huán)素濃度為2.5nM時干預48h對上述分組進行自噬抑制。采用MDC染色法觀察X線照射72h后的自噬現象;平板克隆實驗檢測細胞的增殖活力;成骨誘導21天后茜素紅染色觀察礦化結節(jié)數量;ALP試劑盒檢測礦化能力;Hoechst 33342染色和流式細胞術檢測成骨細胞凋亡情況;免疫印跡法檢測蛋白LC3、Atg5、Beclin-1、p62、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Runx2的表達。結果:平板克隆實驗顯示各輻照組細胞增殖活力明顯降低(P0.05),且有劑量依賴性;茜素紅染色和ALP檢測顯示,輻照組的礦化結節(jié)數量減少(P0.05),礦化程度降低,ALP活性降低,且有劑量依賴性;單丹磺酰尸胺(MDC)染色顯示,各實驗組隨著輻照劑量的增加,熒光強度均有增加;Hoechst 33342細胞凋亡形態(tài)學觀察發(fā)現輻射組在72h后細胞核凝聚數量顯著增多,凋亡小體數目明顯增多;流式細胞術結果顯示輻照組隨著劑量和時間的增加,細胞凋亡率上升(P0.05);Western blot檢測顯示Beclin-1、Atg5、Lc3 II/Lc3 I和除0.25 Gy外的Caspase3蛋白相對表達量隨著輻射劑量的增加均明顯上調,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01);p62和Bcl-2/Bax蛋白表達量明顯下調,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01);Runx2的表達除0.25 Gy外明顯下調,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。MDC染色結果顯示加入2.5nM DOX干預48h后,各輻照組熒光強度基本消失;平板克隆實驗顯示加DOX組細胞增殖活力增高(P0.05);茜素紅染色和ALP檢測顯示加DOX組細胞礦化結節(jié)數量增多(P0.05),ALP活力升高;Hoechst 33342細胞凋亡形態(tài)學觀察發(fā)現加DOX組48h,凋亡小體數目增多;流式細胞術結果顯示加DOX組凋亡率增高(P0.05);Western blot檢測Beclin-1、Atg5、Lc3 II/Lc3 I和除0.25 Gy外的Bcl-2/Bax蛋白相對表達量明顯下調,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);p62在輻射劑量1 Gy-4 Gy時蛋白表達量下調,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);Runx2的表達量均明顯上調,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);Caspase3在輻射劑量2 Gy和4 Gy時蛋白表達量上調,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論:X射線可體外誘導MC3T3-E1成骨細胞發(fā)生凋亡;抑制自噬后,凋亡加重,其機制可能通過激活線粒體釋放凋亡酶激活因子Caspase-3蛋白有關。X射線可體外抑制MC3T3-E1成骨細胞的礦化能力;抑制自噬后,可減輕X射線對成骨細胞礦化能力的損傷,其機制可能與上調ALP活力和成骨相關基因Runx2有關。
【學位單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R739.8
【部分圖文】：

蘭州大學研究生學位論文 基于自噬水平研究 X 射線對成骨細胞的作用2.4 實驗結果2.4.1 多西環(huán)素作用濃度的篩選采用 MTT 法分別檢測加入不同濃度的多西環(huán)素后 24h、48h、72h MC3T3-E1成骨細胞的存活率。結果顯示，多西環(huán)素濃度為 2.5nM 時干預 24h、48h 后生存率與空白對照組沒有顯著差異（P>0.05），并結合 MDC 染色發(fā)現多西環(huán)素在 2.5nM時抑制自噬48h其抑制效果最好，因此，選取多西環(huán)素的作用濃度為濃度為2.5nM。

圖 2 MDC 染色法觀察單純輻照組和 DOX+輻射組 MC3T3-E1 的自噬情況（。放大倍數 200×）Fig. 2 MDC staining was used to observe the autophagy of MC3T3-E1 in the irradiation groupand the DOX+ radiation group. (Magnification 200×).2.4.3 單純 X 射線和抑制自噬后對 MC3T3-E1 成骨細胞增殖活力的影響通過克隆形成實驗，能夠很好的評價細胞對射線的敏感性，平板克隆實驗中，將細胞接種于培養(yǎng)皿后，通過鏡下觀察細胞數>50 個時算作 個克隆。結果顯示，隨著輻射劑量的增加，單純輻照組的克隆形成率逐漸降低，呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）。輻照后加入 DOX 抑制自噬后，與單純輻照組相比，除 0.25 Gy 外，同 劑量下抑制自噬后的 MC3T3-E1 的克隆形成率增高，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。

圖 3 細胞平板克隆實驗觀察單純輻照組和 DOX+輻射組 MC3T3-E1 的增殖情況。(A) 單純輻照組和 DOX+輻射組的增殖活力比較；(B) 單純輻照組和 DOX+輻射組增殖率的數據統(tǒng)計。注：與 Control 組比，##P<0.01，與單純輻照組相比，*P<0.05，**P<0.01Figure 3 Colony formation assay to observe the proliferation of MC3T3-E1 cells irradiated withDOX+radiation alone. (A) Comparison of the proliferation activities of the radiation-only andDOX+ radiation groups; (B) Data statistics of the proliferation rate of the radiation-only and DOX+radiation groups.Note: Compared with Control group, ##P<0.01, compared with radiation alone group, *P<0.05,**P<0.012.4.4 單純 X 射線和抑制自噬后對 MC3T3-E1 成骨細胞礦化及 ALP能力的影響⑴采用茜素紅染色觀察 X 射線對 MC3T3-E1 成骨細胞礦化能力的影響，結果顯示，隨著輻射劑量的增加，其礦化結節(jié)數量明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；輻照后加入 DOX 抑制自噬后，與單純輻照組相比，輻射劑量 2 Gy 和4 Gy 時礦化結節(jié)數量增多，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）如圖 4A、B、C 所示。
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本文編號：2882678