人涎腺黏液表皮樣癌(Mucoepidermoid Carcinoma,MEC)是涎腺最常見的惡性腫瘤,約占涎腺惡性腫瘤的30%,盡管有時表現(xiàn)像良性病變,生長比較慢,但是該腫瘤有時是高度惡性而且預后很差。低分化的涎腺黏液表皮樣癌侵襲和轉(zhuǎn)移能力強,5年的存活率不超過43%。 對于BZAP45(或BZW1)基因的相關研究的文獻不多。至今僅知BZAP45是一種調(diào)節(jié)因子。而對于BZAP45基因是否有其他功能并沒有文獻報道,也未見有BZAP45基因與腫瘤相關的報道。 RNA干擾(RNA interference, RNAi)作用機制為應用小的雙鏈RNA引發(fā)序列特異性的基因表達的“沉默”或“敲除”。在哺乳動物細胞中這種雙鏈RNA可以是短發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA (Small hairpin RNA,shRNA);也可以是3'-端帶有游離堿基的簡單的二聚體(Small interference RNA, siRNA)。轉(zhuǎn)染合成的siRNA所得到的靶基因抑制效果往往時間比較短,而且局限于容易轉(zhuǎn)染的細胞系。應用于RNA干擾的載體有很多種,而利用慢病毒構(gòu)建載體應用于基因沉默,是研究基因功能很好的方法。 在本課題的前期研究中,我們初步發(fā)現(xiàn)在黏液表皮樣癌組織和細胞中,BZAP45均高表達。在此基礎上,本課題構(gòu)建了BZAP45慢病毒干涉載體,將Mc3細胞中的BZAP45基因沉默,觀察其體外和體內(nèi)生物學特性的改變,并對其影響Mc3細胞生物學行為的機制進行初步探索。本課題主要的研究內(nèi)容包括以下幾個方面: 1.進一步確認BZAP45基因在黏黏液表皮樣癌中高表達 為驗證基因芯片結(jié)果正確與否并且明確BZAP45基因是否為黏液表皮樣癌特異性的差異表達基因,我們設計了BZAP45基因?qū)崟r定量PCR的引物,進行實時定量PCR檢測;并預制了BZAP45基因的多克隆抗體,對4例腫瘤組織(制備成15個樣本)和4例正常組織進行了免疫組化染色。結(jié)果顯示,BZAP45基因在黏液表皮樣癌細胞和組織中表達均比正常細胞和組織高。 2. BZAP 45基因RNA干擾慢病毒載載體的制備及黏黏液液表皮樣癌細細胞胞感染 針對靶基因序列,利用公用網(wǎng)站按照RNA干擾序列設計原則,設計4個針對BZAP45基因的RNA干擾靶點序列;合成含干擾序列的雙鏈DNA oligo,其兩端含酶切位點粘端,直接連入酶切后的載體上,將連接好的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入制備好的感受態(tài)細胞,對長出的陽性克隆先進行PCR鑒定,再進行測序比對后,鑒定陽性的克隆即為構(gòu)建成功的BZAP45基因RNA干擾慢病毒載體。選擇干涉效果最好的序列,經(jīng)過病毒的小量包裝、大量包裝、滴度檢測及濃縮后獲得足夠滴度的慢病毒溶液,利用慢病毒載體感染Mc3細胞,利用有限稀釋法挑選陽性單克隆,并利用時定量PCR對獲得的細胞進行鑒定,從而獲得了穩(wěn)定感染的細胞株。 3. BZAP 45基因干涉后Mc3細胞體體體外外及及體體內(nèi)內(nèi)生生物物學學行為的改變 為了研究BZAP45基因在Mc3細胞中可能的作用,我們將BZAP45基因干涉,使其沉默后,利用MTT法、細胞計數(shù)法、平板克隆形成實驗觀、細胞劃痕實驗、transwell實驗、HE染色、透射電鏡等方法察Mc3細胞體外的生物學行為的變化情況,利用裸鼠移植瘤方法觀察了Mc3細胞干涉前后在裸鼠體內(nèi)的生長情況。結(jié)果顯示,BZAP45基因沉默后,Mc3細胞體外增殖變緩,細胞的群體倍增時間由原來的約23 h增為約48 h;克隆形成能力下降,克隆形成率由原來的78%下降為20%;體外遷移能力下降,Mc3、Mc3-NC和Mc3-RNAi三種細胞遷移的距離分別為65.833±4.940μm、64.733±2.684μm和45.667±3.066μm;體外侵襲能力下降,Mc3、Mc3-NC和Mc3-RNAi三種細胞到達小室底面的細胞數(shù)分別為85±6.1、82.0±7.8和24.0±3.7個;細胞超微結(jié)構(gòu)改變,干涉后細胞核染色質(zhì)濃縮、碎裂、邊集于核膜,呈境界清楚的塊狀或半月狀;體內(nèi)成瘤速度變緩,抑瘤率約為57.95%。 4. BZAP 45影響MMCC 3細細細胞胞胞生生生物物物學學行行為為的的機機制初探為研究BZAP45影響MC3細胞生物學行為的機制,我們利用流式細胞儀檢測了干涉前后細胞周期分布的改變,并利用免疫熒光檢測了細胞周期相關因子、凋亡相關因子以及細胞增殖相關因子的表達改變,結(jié)果顯示,BZAP45基因干涉后,細胞出現(xiàn)G1期阻滯,干涉前后p53、c-myc和P21的表達無明顯變化;干涉后,caspase3的表達有所升高,而cyclin-D1和PCNA的表達有所降低。 結(jié)論: 1. BZAP45基因在黏液表皮樣癌組織和細胞中高表達。 2.成功構(gòu)建了BZAP45基因干涉的慢病毒干涉載體。并成功將MC3細胞的BZAP45基因干涉,獲得了穩(wěn)定的細胞株。 3. BZAP45基因被干涉后,Mc3細胞的體內(nèi)和體外的生物學特性發(fā)生改變,細胞的惡性程度下降。 4.BZAP45基因可能與黏液表皮樣癌的發(fā)生和/或發(fā)展有關。
【學位單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2009
【中圖分類】：R739.8
【部分圖文】：

[62]，成功構(gòu)建了自我滅活型載體系統(tǒng)( self-inactivationvectors，SIN)。這一系統(tǒng)保留了野生型病毒(圖1)基因的順式作用元件LTR，包裝信號(φ)，及Rev基因的反應元件。去除了vif，vpr，vpu， nef等致病基因，保證了載體的生物安全性。將編碼病毒衣殼和包膜結(jié)構(gòu)的基因分別克隆于另外兩個質(zhì)粒中，通過三個質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染包裝細胞產(chǎn)生完整的病毒顆粒。也就是說

也就是說，慢病毒載體系統(tǒng)主要由三種包含不同結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒構(gòu)成，分別是轉(zhuǎn)移質(zhì)粒(transfer vectors)，輔助質(zhì)粒(helper plasmids)，包膜表達質(zhì)粒(envelop expression plasmids)。結(jié)構(gòu)如圖2。其中，轉(zhuǎn)移質(zhì)粒除包含我們感興趣的外源基因外，同時還保留了病毒的LTR區(qū)和其他對病毒的整合復制起重要作用的元件。其中LTR區(qū)包含了慢病毒的啟動子、增強子、包裝信號、整合位點(attachment site，Att)等結(jié)構(gòu)。包裝序列能夠使識別病毒RNA將其衣殼化并裝配到病毒顆粒中，Att位點使病毒基因可以整合入宿主基因。同時轉(zhuǎn)移質(zhì)粒中還加入了內(nèi)部啟動子驅(qū)動外源基因轉(zhuǎn)錄。輔助質(zhì)粒整合進入包裝細胞后表達蛋白多聚體gag， 編碼病毒的衣殼蛋白及病毒的其他模序結(jié)構(gòu)(matrix structure)，同時表達蛋白pol， pol蛋白具有逆轉(zhuǎn)錄酶及整合酶的活性

降解機制研究表明，RNAi引起的基因沉默是由dsRNA誘導的多程，長度為2l-23nt的siRNA(small interfering RNoRNA)兩種類型的small RNA發(fā)揮了核心功能作用[92]。，對靶基因進行轉(zhuǎn)錄后負調(diào)控，靶mRNA并不發(fā)生變上的抑制效應，植物中的某些miRNA會與特異mRNA相割，表明miRNA作用類似于siRNA[93]。最新的研究結(jié)果主要作用因子[94]。這里主要對siRNA介導的靶mRNA降以下幾個步驟：形成誘導細胞RNAi的關鍵組分，外源DNA、RNA序列均可RNA，但產(chǎn)生的方式不同。RNA病毒在病毒或細胞中R dependent RNA polymerases，RdRP)的催化下，合

【參考文獻】

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本文編號：2830775