目的：舌癌是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤之一,在我國約占全部口腔癌的40%。舌癌復發(fā)、轉移率高,臨床預后較差。盡管近幾十年來其治療方法不斷得以改進和完善,但患者的五年生存率并未得到顯著提高。腫瘤的局部復發(fā)和區(qū)域性淋巴轉移是舌癌患者治療失敗的主要原因,而腫瘤細胞的遷移和侵襲是腫瘤轉移和復發(fā)過程中的重要因素,因此有關腫瘤細胞遷移和侵襲機制的研究成為該領域的熱點之一。半乳糖凝集素-3(galectin-3,Gal-3)為半乳糖結合蛋白家族成員,具有多種生物學功能,在許多腫瘤細胞的遷移和侵襲過程中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)GaI-3舌癌組織中過表達,但其在舌癌侵襲轉移中的作用和確切機制尚不十分清楚。近年研究發(fā)現(xiàn),Gal-3在某些腫瘤組織中的表達與β-catenin有關。由于β-catenin是經典Wnnt信號傳導通路中的關鍵調控因子,因此我們猜測Gal-3可能通過Wnt/β-catenin信號傳導通路調控舌癌細胞的遷移和侵襲。本課題采用免疫組織化學染色對76例舌癌組織標本中Gal-3的表達進行分析,結合臨床資料研究Gal-3表達與舌癌相關臨床病理因素的關系：應用RNA干擾技術沉默人舌癌細胞系SCC-4和CAL27中Gal-3基因,研究其在舌癌細胞增殖、遷移和侵襲中的作用；通過檢測Gal-3基因沉默前后Wnt/β-catenin(?)言號傳導通路中關鍵因子表達水平的改變,探討Gal-3在舌癌細胞中表達與Wnt/β-catenin信號傳導通路的關系,旨在為進一步闡明舌癌的侵襲和轉移機制提供新的理論依據。 方法：1.采用免疫組織化學SP法,對2005～2010年于山東大學齊魯醫(yī)院口腔頜面外科就診的76例舌癌患者腫瘤組織標本中Gal-3的表達進行檢測,并結合臨床資料分析Gal-3表達與腫瘤分化、臨床分期、區(qū)域淋巴結轉移等臨床病理因素間的關系。 2.將液氮保存的舌癌細胞SCC-4和CAL27于37℃水浴中快速溶化,用預冷的培養(yǎng)基混勻已融化的腫瘤細胞懸液,在4℃下1800rpm離心10min。棄上清,重懸細胞于新鮮培養(yǎng)液中,SCC-4采用RPMI640,CAL27采用高糖DMEM培養(yǎng)基進行常規(guī)培養(yǎng)。收集對數生長期細胞用于實驗。 3.采用陽離子脂質體法進行轉染。將細胞分為空白對照組、陰性對照組和實驗組,按照Invitrogen公司LpofectamineTM RNAiMAX試劑說明書操作,分別將control-siRNA和Gal-3-siRNA瞬時轉入陰性對照組和實驗組細胞,空白對照組細胞不做任何處理。37℃,5%CO2條件下培養(yǎng)6h后,替換為含血清的生長培養(yǎng)基。轉染后481h,對細胞生物學行為以及相關因子的表達進行檢測。 4.轉染后48h收集各組細胞,采用Trizol(?)去提取總RNA。采用TIANGEN公司Quantscript RT K it試劑盒,取模板RNA1μg,加入反轉錄反應體系,合成cDNA第一鏈。應用TIANGEN公司RealMasterMix(SYBR Green)試劑盒,以1μl cDNA為模板,在7500Real Time PCR System中進行擴增,應用Sequence Detection Software version1.4對Gal-3的表達進行分析。以β-肌動蛋白(β-actin)作為內參照。引物序列為：Gal-3上游引物5'-GGCCACTGA-TTGTGCCTTAT-3',下游引物5'-TGCAACCTTGAAGTGGTCAG-3';β-actin上游引物5'-CTCCTC-CTGAGCGC AAGTACTC-3',下游引物5-TCCTGCTTGCTGATCCACATC-3'。 5.轉染后48h收集細胞,用RIPA細胞裂解液提取細胞總蛋白。采用BCA法進行蛋白定量。取50μg蛋白上樣,12%SDS-PAGE膠垂直電泳后電轉移至PVDF膜,用5%脫脂奶粉封閉過夜,加入1：1000兔抗人Gal-3多克隆抗體,4℃反應過夜,TBST洗膜,加入1：2000辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG,室溫孵育2h,ALP顯色。掃描、分析Gal-3蛋白的表達。以β-actin (?)乍為內參照。 6.采用MTT法檢測細胞的增殖能力。細胞接種于96孔板,每孔細胞數約為2.0×103。37℃,5%CO2條件下過夜,細胞達到鋪滿30～50%時進行轉染。分別于轉染后0h、24h、48h和72h在每孔加入CCK-810μl,繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)4h。用酶標儀測定在450nm處的吸光度(OD值),記錄結果。以時間為橫軸,OD值為縱軸繪制細胞生長曲線。 7.將適當密度轉染后的細胞接種于24孔培養(yǎng)板,形成細胞單層。用移液器滴頭沿培養(yǎng)板底部形成“一”字劃痕。鏡下記錄劃痕相對距離,更換體積分數為1%胎牛血清的RPMI1640/H-DMEM培養(yǎng)基,24h后更換體積分數為10%胎牛血清的RPMI1640/H-DM EM培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24h,鏡下觀察各組腫瘤細胞遷移能力的差異。 8.應用Yranswell小室法觀察Gal-3基因沉默對SCC-4和CAL27細胞侵襲能力的影響。RNA干擾后48h,收集各組細胞,制備單細胞懸液,調整細胞密度為2×106/ml。將細胞懸液加入Transwell小室中,每孔100μl,將小室浸于24孔板的條件培養(yǎng)基中,37℃,5%CO2孵箱內孵育8h。取出Transwell小室,濾膜用甲醇固定1分鐘。HE染色,顯微鏡下觀察、照相并計數。 9.轉染后48h,收集各組細胞,采用WB法對對腫瘤細胞中β-catenin蛋白的表達水平進行檢測；采用RealTime RT-PCR法對其mRNA的表達進行檢測。β-catenin引物序列為：上游引物5'-GCCGGCTATTGTAGAAGCTG-3',下游引物5'-GAG-TCCCAAGGAGACCTTCC-3'。采用免疫熒光法染色,并應用共聚焦顯微鏡觀察轉染前后β-catenin在SCC-4亞細胞結構中定位的變化情況。 10.轉染后48h,采用相同方法檢測各組細胞中Akt、pAkt、GSK-3β和pGSK-3β蛋白的表達。并于轉染后0h、12h、24h和48h,檢測實驗組SCC-4細胞中Gal-3、β-catenin、pAkt和pGSK-3β蛋白的表達。 11.為進一步明確Akt磷酸化在Gal-3/β-catenin軸中的作用,分別采用Akt抑制劑和(或)Gal-3-siRNA對SCC-4進行處理。Gal-3-siRNA轉染后48h,采用WB法檢測各組細胞中Akt、pAkt和β-catenin蛋白的表達。 12.為證實Gal-3沉默系通過抑制Wnt/β-catenin信號通路下游靶基因的表達影響舌癌細胞的遷移和侵襲,于轉染后48h,分別采用RT-PCR法和WB法檢測SCC-4中MMP-9mRNA及蛋白的表達。 結果：1.76例患者腫瘤組織標本中Gal-3表達的陽性率為86.8%。著色主要位于腫瘤上皮細胞和腫瘤間質中纖維細胞的胞漿,胞核染色為陰性。Gal-3表達的強度與頸淋巴結轉移和腫瘤臨床分期有關,與患者年齡、性別、腫瘤大小及組織分化程度等因素無顯著相關性。 2.實驗發(fā)現(xiàn),在轉染后48h,Gal-3-siRNA處理組Gal-3mRNA及蛋白的表達明顯受到抑制。Gal-3-siRNA轉染對SCC-4和CAL27細胞Gal-3mRNA表達的抑制率分別為99.4%和98.6%。實驗組細胞中Gal-3蛋白的表達亦顯著降低。在腫瘤細胞生物學行為方面,實驗顯示,在轉染后72h內,Gal-3-siRNA處理組腫瘤細胞在增殖能力方面較陰性對照組和空白對照組無顯著下降。而細胞劃痕實驗顯示,Gal-3沉默可顯著降低兩種細胞的遷移能力。Gal-3-siRNA處理組細胞的劃痕愈合時間較陰性對照組組和空白對照組明顯延長。此外,實驗通過Transwell小室法證實,抑制Gal-3基因的表達可顯著降低舌癌細胞的侵襲能力。 3.本研究對Gal-3-siRNA作用后舌癌細胞中β-catenin(?)勺表達進行檢測發(fā)現(xiàn),Gal-3沉默可顯著影響腫瘤細胞中β-catenin蛋白的水平。為明確Gal-3對β-catenin表達的調控是否發(fā)生在轉錄階段,我們對β-catenin mRNA的水平進行了檢測。實驗發(fā)現(xiàn)雖然Gal-3沉默導致β-catenin蛋白下調,但其mRNA的表達水平并未發(fā)生顯著改變。提示Gal-3沉默對β-catenin表達的影響發(fā)生在轉錄后階段。通過免疫熒光法染色,觀察轉染前后β-catenin在SCC-4亞細胞結構中定位發(fā)現(xiàn),在SCC-4中Gal-3-siRNA轉染后48h,β-catenin在胞漿與胞核中的表達均顯著降低。 4.為明確Gal-3在β-catenin表達調控中的作用機制,我們對Wnt信號傳導通路中的關鍵調控因子Akt和GSK-3β的總蛋白和磷酸化蛋白的水平進行了檢測。研究發(fā)現(xiàn),在各組細胞中Gal-3沉默并未導致Akt和GSK-3p總蛋白水平發(fā)生明顯變化,然而在實驗組細胞中兩種蛋白的磷酸化形式顯著降低。相反,對照組中pAkt和pGSK-3β的水平無明顯變化。本研究還對實驗組SCC-4細胞中Gal-3、pAkt、pGSK-3β以及β-catenin蛋白水平的時相變化進行了分析。實驗結果顯示,Gal-3、pAkt、pGSK-3β及β-catenin的水平均較轉染前顯著降低。同時,研究發(fā)現(xiàn)pAkt和pGSK-3β(?)水平的降低發(fā)生于轉染后12小時,早于β-catenin蛋白下調發(fā)生的時間。此外,本研究發(fā)現(xiàn)應用Akt抑制劑抑制Akt磷酸化與應用Gal-3-siRNA沉默Gal-3基因的表達均可導致SCC-4中β-catenin蛋白表達顯著下降。應用Akt抑制劑后,再加入Gal-3-siRNA不會引起β-catenin蛋白水平進一步降低。 5.應用RT-PCR(?)去和WB法檢測發(fā)現(xiàn),轉染后48h舌癌細胞SCC-4中MMP-9mRNA和蛋白表達水平均顯著降低。 結論：1.Gal-3過表達與舌癌的侵襲和轉移相關。 2.沉默Gal-3可顯著抑制舌癌細胞SCC-4與CAL27的遷移和侵襲能力。 3.抑制Gal-3基因表達,可導致舌癌細胞中β-catenin蛋白水平下調,但不影響其轉錄；Gal-3基因沉默使β-catenin蛋白在胞漿與胞核中的水平均顯著降低。 4.Gal-3表達可能通過活化Akt,調控GSK-3β磷酸化水平及胞漿p-Catenin的快速降解過程,從而作用于Wnt信號通路下游靶基因,最終影響舌癌細胞的遷移和侵襲。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2012
【中圖分類】：R739.8

【共引文獻】

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本文編號：2824577