【摘要】：背景和目的上皮根鞘(Hertwig's epithelial root sheath,HERS)作為啟動牙根的信號中心,在牙根發(fā)育中必不可少。牙根的正常生理過程與HERS完整的形成、適時的斷裂及細胞增殖、凋亡密切相關(guān)。牙本質(zhì)發(fā)育不良I型(Dentin dysplasia type I,DD-I)又稱為根部牙本質(zhì)發(fā)育不良,是一種牙根嚴重發(fā)育不良導致根短小、畸形的常染色體顯性遺傳病。細胞液泡分選蛋白4B(Vacuolar protein sorting 4B,VPS4B)是一種多功能蛋白,在調(diào)控細胞增殖凋亡、溶酶體降解、細胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運等過程中起重要作用。本課題組前期對一個DD-I家系外周血全基因組測序發(fā)現(xiàn)該家系致病基因為VPS4B;并且研究表明VPS4B可能是影響牙齒發(fā)育的重要基因,但是其在牙根發(fā)育過程中的具體作用不是很清楚。本實驗通過Vps4b基因敲除小鼠模型,觀察HERS在牙根發(fā)育過程中的形態(tài)變化,分析該基因突變對HERS細胞增殖、凋亡能力的影響,進而探討該基因在牙根致畸中的可能作用。材料與方法將Vps4b基因敲除小鼠雌雄合籠交配,記錄出生后(Postnatal,P)時間。分別于P5天、P9天、P11天、P15天、P19天引頸處死解剖分離下頜第一磨牙區(qū)下頜骨和小鼠尾巴。新生幼鼠的基因型使用PCR技術(shù)進行鑒定。將幼鼠下頜骨采用4%多聚甲醛溶液固定、10%EDTA脫鈣、石蠟包埋,制備切片,使用蘇木精-伊紅(Haematoxylin and eosin,HE)染色的方法確定各組小鼠牙根發(fā)育時期,免疫組織化學方法對不同時期HERS細胞內(nèi)細胞角蛋白14(Cytokeratin14,CK14)、增殖細胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)以及B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)進行組織定位,對比野生小鼠和Vps4b基因敲除小鼠CK14、PCNA、Bcl-2蛋白表達的差異。結(jié)果PCR的檢測結(jié)果顯示子代小鼠基因型為正常型Vps4b~(+/+)和雜合型Vps4b~(+/-)兩種。正常小鼠HE染色顯示:小鼠P5天HERS形成,牙根發(fā)育開始;P9天HERS結(jié)構(gòu)連續(xù),根分叉結(jié)構(gòu)形成;P11天HERS發(fā)生斷裂;P15天根1/3開始形成;P19天牙根發(fā)達到生理性長度,HERS繼續(xù)斷裂,其末端保持完整。正常小鼠免疫組織化學染色結(jié)果:P5天,HERS形成雙層細胞結(jié)構(gòu),HERS細胞PCNA陽性表達,Bcl-2無表達;P9天,HERS仍連續(xù)并繼續(xù)延伸,HERS細胞PCNA強陽性表達,Bcl-2陽性表達;P11天,HERS開始發(fā)生斷裂,HERS末端保持完整,牙頸部有少量細胞PCNA陽性表達,HERS末端部分PCNA強陽性表達,Bcl-2在HERS細胞中弱陽性表達;P15天,牙根表面很少見到PCNA陽性的HERS細胞,HERS末端PCNA仍強陽性表達,HERS細胞Bcl-2弱陽性表達;P19天,牙根發(fā)育基本完成,僅HERS末端PCNA陽性表達,Bcl-2陰性表達。Vps4b基因敲除后抗CK14蛋白顯示HERS在P9天開始發(fā)生斷裂,P15天以后HERS不連續(xù),HERS細胞數(shù)量減少,并形成細胞簇附著在牙根表面;與正常小鼠相比,PCNA在HERS細胞中表達強度變?nèi)?P0.05),HERS細胞僅在P9天、P11天Bcl-2呈陽性表達并且表達強度減弱(P0.05)。結(jié)論在Vps4b~(+/-)小鼠牙根發(fā)育過程中HERS的連續(xù)性過早中斷,提示Vps4b基因的缺失影響HERS正常形態(tài)的形成。HERS細胞PCNA、Bcl-2的表達強度減弱,推測Vps4b可能通過調(diào)節(jié)HERS細胞的增殖、凋亡進而影響牙根的發(fā)育。
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R78
【圖文】：

可擴增出一條 425bp條帶，隱性純合型無條帶（如圖 4.1）。圖4.1 小鼠Vps4b gDNA擴增結(jié)果圖：A. 以F1/R1為引物擴增出2條條帶；B. 以 F1/R2 為引物擴增一條條帶

圖 5.2-1 各期牙根 HE 染色：A:P5 HERS 開始形成；B：P9 根分叉開始；C：P11 HERS開始斷裂；D：P15，根 1/3 形成；E：P19 牙根基本發(fā)育完成。HERS：上皮根鞘；Am:成釉細胞；DP：牙乳頭；DF：牙囊；Fur:根分叉結(jié)構(gòu)。×40

圖 5.2-1 各期牙根 HE 染色：A:P5 HERS 開始形成；B：P9 根分叉開始；C：P11 HERS開始斷裂；D：P15，根 1/3 形成；E：P19 牙根基本發(fā)育完成。HERS：上皮根鞘；Am:成釉細胞；DP：牙乳頭；DF：牙囊；Fur:根分叉結(jié)構(gòu)。×40

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本文編號：2792039