【摘要】：目的:通過建立骨皮質(zhì)切開術(shù)加速牙移動(dòng)動(dòng)物模型,研究巨噬細(xì)胞在骨皮質(zhì)切開介導(dǎo)的正畸牙移動(dòng)加速進(jìn)程中的作用及機(jī)制,為巨噬細(xì)胞調(diào)控正畸牙移動(dòng)提供新的證據(jù)。材料與方法:將8周齡雄性Wistar大鼠及8周齡成年雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組(CO+TM),對照組(TM)和空白組。分別對實(shí)驗(yàn)組,對照組大、小鼠上頜左側(cè)第一磨牙實(shí)施正畸加力,同時(shí)對實(shí)驗(yàn)組同期行骨皮質(zhì)切開術(shù)。分別在第3 d,5 d,7 d,14 d,21 d,28 d,42 d七個(gè)時(shí)間點(diǎn)收取大鼠,第5 d,7 d,14 d,21 d四個(gè)亞組收取小鼠。取上頜骨行Micro-CT檢查,測量牙齒移動(dòng)距離及移動(dòng)牙周圍骨密度改變。通過免疫組化染色技術(shù)觀察大鼠牙周形態(tài)學(xué)改變、破骨細(xì)胞及巨噬細(xì)胞浸潤。取大鼠移動(dòng)磨牙腭側(cè)牙齦,通過RT-PCR檢測巨噬細(xì)胞數(shù)量以及極性分化標(biāo)志物mRNA表達(dá)水平,并通過流式細(xì)胞術(shù)檢測巨噬細(xì)胞極性分化。隨后通過注射氯膦酸鹽建立巨噬細(xì)胞清除模型,進(jìn)一步驗(yàn)證巨噬細(xì)胞的作用。通過牙周組織與骨髓源性巨噬細(xì)胞共培養(yǎng),RT-PCR檢測巨噬細(xì)胞極性分化改變,Western blot檢測巨噬細(xì)胞極化相關(guān)蛋白p65以及STAT3磷酸化水平。結(jié)果:1.骨皮質(zhì)切開術(shù)顯著加速大鼠牙齒移動(dòng)距離與速率:在牙齒移動(dòng)第5天到第42開,實(shí)驗(yàn)組的移動(dòng)距離顯著高于對照組并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。牙齒移動(dòng)初期(第3天)牙齒移動(dòng)速率最大,且對照組高于實(shí)驗(yàn)組,而后兩組大鼠移動(dòng)速率開始降低,直至第14天,為速率變化的轉(zhuǎn)折點(diǎn),其后移動(dòng)速率又開始提高。第21天時(shí),實(shí)驗(yàn)組的移動(dòng)速率明顯高于對照組。我們通過骨密度測量發(fā)現(xiàn),實(shí)驗(yàn)組骨密度在牙移動(dòng)的第3、7、14、28天均顯著低于對照組。2.骨皮質(zhì)切開術(shù)促進(jìn)牙移動(dòng)中牙周組織中破骨細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的增加:通過TRAP染色發(fā)現(xiàn),在第14天左右破骨細(xì)胞數(shù)量達(dá)頂峰,且實(shí)驗(yàn)組顯著高于對照組。通過免疫組化染色發(fā)現(xiàn),從第5天到第42天,實(shí)驗(yàn)組大鼠移動(dòng)牙壓力側(cè)棕黃色的CD11b陽性細(xì)胞陽性率顯著高于對照組;而實(shí)驗(yàn)組壓力側(cè)棕黃色的CD68陽性細(xì)胞陽性率則在第5-14天時(shí)顯著高于對照組。通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)CD68和CD11b基因在實(shí)驗(yàn)組和對照組的表達(dá)變化趨勢基本一致。但實(shí)驗(yàn)組CD68和CD11b基因的表達(dá)量在第5-21天顯著高于對照組。同時(shí),流式細(xì)胞術(shù)檢測分析顯示實(shí)驗(yàn)CD11b~+細(xì)胞陽性率從第5天到第21天始終高于對照組。3.骨皮質(zhì)切開術(shù)促進(jìn)牙移動(dòng)中巨噬細(xì)胞的極化:通過免疫組化染色顯示,從第5天到第21天,實(shí)驗(yàn)組大鼠移動(dòng)牙壓力側(cè)棕黃色的CD86顯著高于對照組(TM);同時(shí),除第14天外實(shí)驗(yàn)組壓力側(cè)棕黃色的CD163陽性細(xì)胞率也顯著高于對照組。流式細(xì)胞術(shù)檢測分析顯示實(shí)驗(yàn)組CD11b~+CD86~+細(xì)胞陽性率從第5天到第21天始終高于對照組,而實(shí)驗(yàn)組CD11b~+CD163~+細(xì)胞陽性率除第14天外都顯著高于對照組。通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組和對照組CD86基因的表達(dá)量在第5天到第14天呈逐步上升趨勢,且實(shí)驗(yàn)組顯著高于對照組。而實(shí)驗(yàn)組與對照組在CD163基因的表達(dá)量上趨勢基本一致,且實(shí)驗(yàn)組CD163基因的表達(dá)量除第42天均顯著高于對照組。與CD86基因表達(dá)量相一致的是,炎癥型巨噬細(xì)胞相關(guān)因子IL-1β及TNF-α的基因表達(dá)量在牙移動(dòng)早中期第5天和第14天時(shí)即顯著性的高于對照組;而修復(fù)型巨噬細(xì)胞相關(guān)因子Arg-1及CD206表達(dá)量在牙移動(dòng)早期第5天時(shí)和第21天時(shí)顯著高于對照組。4.巨噬細(xì)胞清除抑制了骨皮質(zhì)切開術(shù)引起的牙齒加速移動(dòng):在巨噬細(xì)胞清除模型中,與對照組相比,巨噬細(xì)胞清除組循環(huán)來源的單核細(xì)胞降低了70%,且巨噬細(xì)胞清除組牙齦組織中CD11b~+F4/80~+細(xì)胞陽性率也明顯降低,其中,CD86~+和CD206~+細(xì)胞陽性率也明顯降低。我們進(jìn)一步通過Micro-CT觀察了小鼠牙齒移動(dòng)的基本情況。實(shí)驗(yàn)組的移動(dòng)距離在第5天到第21天均顯著大于對照組,而該移動(dòng)距離增加的現(xiàn)象則在巨噬細(xì)胞清除后明顯降低,同時(shí),在巨噬細(xì)胞清除后,巨噬細(xì)胞清除組第5天到第14天中牙移動(dòng)速率顯著低于骨皮質(zhì)切開組。5.骨皮質(zhì)切開術(shù)通過NF-κB及JAK-STAT信號(hào)通路調(diào)控巨噬細(xì)胞極化分型:通過對小鼠骨髓源性巨噬細(xì)胞(BMDMs)給予新鮮牙齦組織懸液刺激并運(yùn)用RT-PCR分析巨噬細(xì)胞分型情況,結(jié)果顯示,炎癥型巨噬細(xì)胞相關(guān)因子TNF-α及IL-1β的基因表達(dá)量在牙移動(dòng)早中期第5天和第14天時(shí)即顯著性的高于對照組,隨后開始下降。而修復(fù)型巨噬細(xì)胞相關(guān)因子Arg-1及CD206表達(dá)量在牙移動(dòng)早期第5、14和21天時(shí)顯著高于對照組且實(shí)驗(yàn)組兩種目的基因的表達(dá)量總體趨勢基本一致,即在第5天時(shí)表達(dá)增高而后第14天時(shí)開始下降直到第21天再次回升。通過western blot對巨噬細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn),與對照組相比,骨皮質(zhì)切開組p65蛋白表達(dá)量在刺激第5-7天時(shí)顯著增高。同時(shí),磷酸化的STAT3蛋白表達(dá)量在第5天時(shí)顯著高于對照組,而后開始下降,并在第21天時(shí)再次增高并顯著高于對照組。結(jié)論:骨皮質(zhì)切開術(shù)可以促進(jìn)局部微環(huán)境中巨噬細(xì)胞的募集并極化改變,進(jìn)而加速正畸牙移動(dòng),其中NF-κB及JAK-STAT信號(hào)通路的激活在巨噬細(xì)胞極化中發(fā)揮重要作用。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R783.5
【圖文】：

切口長約3 mm，穿透牙齦，深達(dá)骨膜下1 mm。每日使用生理鹽水沖洗上頜磨牙并24h監(jiān)控大小鼠口內(nèi)的加力裝置，若有損壞或脫落，及時(shí)重新安裝。圖1 動(dòng)物模型示意圖A圖：左上頜第一磨牙加載正畸加力裝置；B圖：箭頭所示為第一磨牙近遠(yuǎn)中切口；C圖：箭頭所示為預(yù)實(shí)驗(yàn)翻瓣后所見的切口2.4體內(nèi)清除巨噬細(xì)胞動(dòng)物模型的建立實(shí)驗(yàn)組小鼠再隨機(jī)分為兩組（5-6只/組）：氯膦酸鹽清除組（CO + TM + LEC）和對照組（CO + TM）。氯膦酸鹽清除組小鼠從牙移動(dòng)的前一天開始每隔4天通過眼球后靜脈叢注射氯膦酸鹽以清除巨噬細(xì)胞，建立巨噬細(xì)胞清除模型，對照組小鼠則注射PBS做對照[37]。在巨噬細(xì)胞清除組中建立骨皮質(zhì)切開加速正畸模型，并于術(shù)后 5、7、14、21 d處死（圖2）。

南京醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文18圖2 體內(nèi)清除巨噬細(xì)胞動(dòng)物模型的建立2.5樣本采集所有大小鼠分別在預(yù)定加力截止當(dāng)天注射過量麻藥后頸椎脫位處死。采集移動(dòng)磨牙的腭側(cè)牙齦，用于RT-PCR分析（5-6只/組）和流式細(xì)胞術(shù)檢測（5-6只/組）。同時(shí)取移動(dòng)磨牙的腭側(cè)牙齦（6只/組），加入含1% FBS的DMEM培養(yǎng)液中，用研磨法制成單細(xì)胞懸液后，無菌條件下0.22μm過濾器過濾后得無菌牙齦組織溶液。同時(shí)將上頜骨完整取出，4%多聚甲醛固定48 h后，進(jìn)行Micro-CT掃描分析及組織學(xué)檢測。2.6骨髓源性巨噬細(xì)胞細(xì)胞的分離培養(yǎng)和刺激用DMEM完全培養(yǎng)基(含10% FBS)于37°C、5%的CO2孵箱中培養(yǎng)L929細(xì)胞3~ 5 d，然后收集細(xì)胞上清，無菌條件下0.22μm過濾器過濾后備用。（1）斷頸處死雄性 4 周齡 C57BL/6 小鼠，投入 75%酒精中浸泡 3-5 分鐘

CD86+和 CD206+細(xì)胞陽性率也明顯降低（圖6F，6G）。我們進(jìn)一步通過 Micro-CT 觀察了小鼠牙齒移動(dòng)的基本情況。實(shí)驗(yàn)組的移動(dòng)距離在第 5 天到第 21 天均顯著大于對照組（圖 6H，6I），而該移動(dòng)距離增加的現(xiàn)象則在巨噬細(xì)胞清除后明顯降低，同時(shí)，在巨噬細(xì)胞清除后，巨噬細(xì)胞清除組第 5 天到第 14 天中牙移動(dòng)速率顯著低于骨皮質(zhì)切開組（圖 6J）。結(jié)果提示巨噬細(xì)胞在骨皮質(zhì)切開術(shù)加速正畸牙移動(dòng)中發(fā)揮了重要作用。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

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本文編號(hào)：2786404