【摘要】： 隨著人口老齡化問題日益嚴(yán)重，口腔修復(fù)患者中原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的老年患者越來越多。由于骨質(zhì)疏松導(dǎo)致骨量不足、骨密度過低，不能進行正常的種植修復(fù)，或者常規(guī)修復(fù)效果不理想。如何治療和控制骨質(zhì)疏松的發(fā)病，解決因此帶來的骨量不足，重建骨組織的健康結(jié)構(gòu)和功能，是口腔醫(yī)學(xué)，骨整形、以及骨缺損重建等臨床醫(yī)學(xué)所關(guān)心的問題。 甲狀旁腺激素(PTH)是一種重要的體內(nèi)維持鈣穩(wěn)態(tài)及骨代謝的全身性調(diào)節(jié)激素，其靶細胞為成骨細胞和腎小管細胞。2002年12月，F(xiàn)orteo商品名叫特立派汰的人工合成PTH被FDA認證，作為治療骨質(zhì)疏松藥物。研究證明，PTH對依據(jù)給藥方式不同對骨組織產(chǎn)生雙重作用。小劑量、間斷式甲狀旁腺激素(PTH)皮下注射能有效地促進骨骼合成；持續(xù)作用刺激骨轉(zhuǎn)化，增加破骨細胞的活性和降低皮質(zhì)骨量，導(dǎo)致松質(zhì)骨喪失。PTH主要通過骨形成的三個階段發(fā)揮作用的：1，刺激前期成骨細胞增殖；2，促進前期成骨細胞，但是抑制成熟的成骨細胞的分化；3，抑制成骨細胞凋亡。其中是否前期成骨細胞增殖提高還不是很清楚。PTH對骨組織的另一重作用是持續(xù)性大劑量注射PTH，則抑制成骨細胞增殖分化，活化破骨細胞。 通過PTH以及應(yīng)力對成骨細胞作用機制的研究發(fā)現(xiàn)，二者對成骨細胞的影響有很多共同的作用機理，這預(yù)示PTH和機械應(yīng)力之間可能有著某種協(xié)同關(guān)系。有關(guān)PTH對成骨樣細胞的機械應(yīng)力響應(yīng)的調(diào)節(jié)作用的基礎(chǔ)研究，目前還未見國內(nèi)報道。因此，有必要對PTH調(diào)控成骨樣細胞的機械響應(yīng)機制作進一步的研究，并尋求發(fā)現(xiàn)PTH和機械應(yīng)力間的內(nèi)在聯(lián)系。 目的： 本課題旨在通過對體外培養(yǎng)的人成骨樣細胞MG63，加載不同強度的牽張刺激，通過測定不同刺激強度對該細胞的線粒體跨膜電位(Δψ，m)、ALPase、細胞增殖及細胞內(nèi)鈣離子濃度的變化，初步篩選出一個牽張閾值；進而采用低濃度的甲狀旁腺激素(20ng／ml)，采用間斷和持續(xù)作用于閾上刺激后的人成骨樣細胞MG63，通過觀察其礦化結(jié)節(jié)的形成情況，以及采用RT-PCR技術(shù)檢測人甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白(PHT／PTHrP)和骨鈣素(OCN)的mRNA表達情況，初步探討甲狀旁腺激素對不同機械力作用下的成骨樣細胞的生物學(xué)效應(yīng)。以期探討通過全身或局部藥物作用，來影響機械載荷下的牙槽骨改建，預(yù)防或減緩其吸收。為口腔修復(fù)、種植和正畸臨床醫(yī)學(xué)提供基礎(chǔ)性的研究。 方法： 1．采用低滲透液式加力方式，對體外培養(yǎng)的細胞進行牽張刺激。采用不同濃度的甘露醇調(diào)節(jié)低滲透壓的大小，模擬體外細胞受力的強度。 2．采用人成骨樣細胞MG63的細胞株進行體外培養(yǎng)，觀察細胞形態(tài)，繪制細胞生長曲線為低滲透壓加載實驗準(zhǔn)備實驗細胞。 3．采用低滲透壓對體外培養(yǎng)的MG63進行加載，通過激光掃描共聚焦顯微鏡觀測細胞線粒體形態(tài)，圖像分析軟件分析線粒體跨膜電位的變化；通過分析ALP以及細胞內(nèi)鈣離子濃度的變化分析低滲透壓對MG63的影響，初步篩選出一個低滲透壓閾值，為后期PTH實驗研究準(zhǔn)備實驗條件。 4．采用化學(xué)熒光檢測技術(shù)，對加入細胞培養(yǎng)基中不同時間的PTH的免疫活性進行藥物動力學(xué)檢測，分析PTH的代謝特性，并繪制代謝曲線。排除由于PTH代謝導(dǎo)致藥效濃度過低，可能產(chǎn)生的實驗結(jié)果的偏差。 5．對閾上刺激后的MG63進行低濃度的PTH間斷和連續(xù)刺激，采用RT-PCR技術(shù)檢測細胞內(nèi)甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白PHT／PTHrP和骨鈣素OCN的mRNA表達情況。 6．采用茜素紅染色技術(shù)，觀察PTH作用前后的MG63礦化誘導(dǎo)情況，并采用分光光度儀定量檢測鈣化結(jié)節(jié)的情況。 結(jié)果： 1．通過對線粒體膜電位的檢測發(fā)現(xiàn)，隨著滲透壓的降低，以及作用的時間延長，膜電位有增高的趨勢，其中277mOsm膜電位輕度增高，但與對照組沒有明顯差別(P＞0.05)；240mOsm組的膜電位總體高于對照組(P＜0.05)，且作用2h、4h和6h時，膜電位明顯高于對照組，在作用4h時達到峰值。163mOsm在作用初期，就有明顯的膜電位增高，但是隨著作用時間的延長，膜電位降低，且作用4h以后，已經(jīng)明顯低于對照組(P＜0.05)。 2．通過MTT生長曲線分析發(fā)現(xiàn)所有細胞均近似“s”形，有明顯的滯留期、指數(shù)生長期、平臺期。隨著滲透壓的降低，細胞滯留期變短，對數(shù)生長期提前，較早進入平臺期。 3．通過對低滲壓作用后的MG63的ALP，以及胞內(nèi)鈣離子濃度〔Ca~(2+)〕_i變化分析發(fā)現(xiàn)，低滲處理組中，277mOsm、240mOsm和163mOsm組早期ALP活性降低，以后隨著作用時間延長，有所增加，但是仍然低于對照組。三個低滲處理組中各時間組的〔Ca~(2+)〕_i均高于對照組(P＜0.05)，且隨著作用時間延長也是呈現(xiàn)增高趨勢，分別在24h、12h和8h達到峰值，以后逐漸回落，但是仍然明顯高于對照組。 4．通過對PTH藥物動力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在實驗設(shè)計的觀測期內(nèi)(24h)，PTH的免疫活性沒有明顯降低。說明實驗設(shè)計的觀測期合理，排除了實驗結(jié)果是由于激素代謝導(dǎo)致藥效降低引起的誤差。 5．PTH對成骨樣細胞MG63的礦化影響具有時間依賴性，與藥物濃度關(guān)系不大。 6．間斷使用PTH和牽張力具有刺激成骨樣細胞MG63增殖分化的作用；小劑量、間斷PTH刺激應(yīng)力狀態(tài)下的成骨樣細胞6h，PTHrPmRNA高表達，OCmRNA表達受到抑制。刺激3h則PTHrPmRNA的表達降低，而OCmRNA表達輕度升高；作用1h則PTHrPmRNA和OCmRNA的表達與對照組沒有明顯差異；相反PTH連續(xù)作用24h時，PTHrPmRNA和OCmRNA的表達均明顯降低。 7．間斷低濃度使用hPTH1-34，有助于應(yīng)力載荷后的成骨增殖活力的恢復(fù)，緩解過載荷狀態(tài)下成骨細胞的增殖抑制，利于基質(zhì)骨礦化的形成；且加強地塞米松的成骨誘導(dǎo)作用 結(jié)論： 1．低滲透液作為一種應(yīng)用于研究細胞離子通道的加力方式，同樣可以適用于研究細胞體外受力的生物學(xué)特性。其隨著滲透壓的逐漸降低，對成骨樣細胞所產(chǎn)生的作用效果，與以往采用四點彎曲等加載方式有著一定的相似作用趨勢。 2．采用低滲透液進行細胞體外受力研究發(fā)現(xiàn)，在一定條件下(270～240mOsm，作用4—6小時)，對成骨樣細胞MG63具有促進增殖分化的作用，過強(163mOsm，作用4—6小時)、過小(270mOsm，作用0.5—2小時)的應(yīng)力都不利于該細胞成熟分化。 3．對閾上刺激后的MG63，采用小劑量(20ng／ml) hPTH1-34的間斷誘導(dǎo)，具有調(diào)節(jié)PTHrPmRNA和OCmRNA的表達的作用。其中對閾上刺激后4h，PTH間斷作用6h，細胞的PTHrPmRNA的表達明顯增高，OCmRNA的表達則受到一定的抑制作用。結(jié)合胞內(nèi)游離鈣濃度的變化，說明兩種基因表達的變化可能與胞內(nèi)鈣離子通道有關(guān)。同時，該實驗條件下的細胞礦化誘導(dǎo)后基質(zhì)的礦化結(jié)節(jié)形成增多。也提示hPTH1-34對閾上刺激后的MG63的影響與鈣離子通道之間有一定的關(guān)系。 4．現(xiàn)有細胞學(xué)實驗，為動物應(yīng)力損傷實驗奠定了基礎(chǔ)，將有助于更深層次的了解PTH對骨組織機械學(xué)響應(yīng)的影響作用。
【學(xué)位授予單位】：四川大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R783;R580

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